Epimedin-B 通过靶向 MCOLN1/TRPML1 通道阻断自噬流
已有研究证实，TNBC 细胞中自噬活性显著高于非 TNBC 细胞，且自噬相关基因的高表达与 TNBC 患者的不良预后密切相关，因此抑制自噬流成为调控 TNBC 进展的潜在策略。
溶酶体作为自噬过程的核心细胞器，其功能稳态依赖于离子平衡、酸性环境及膜融合能力的协同维持。MCOLN1/TRPML1 作为定位于溶酶体膜上的非选择性阳离子通道，可介导 Ca²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺等金属离子的溶酶体释放，在自噬体 - 溶酶体融合、溶酶体生物发生及细胞离子稳态调控中发挥核心作用。已有研究表明，MCOLN1/TRPML1 可通过调控 Zn²⁺ influx 干扰自噬体膜上 STX17 与溶酶体膜上 VAMP8 的相互作用，或通过 Ca²⁺- 钙调蛋白依赖机制激活 mTORC1 抑制自噬起始，进而影响肿瘤细胞的自噬活性。
天然产物因其来源广泛、毒性较低、多靶点作用等优势，在肿瘤调控研究中备受关注。淫羊藿作为传统中药，其主要活性成分黄酮类化合物已被证实具有抗炎、抗氧化、调控肿瘤微环境等多种生物活性，其中淫羊藿苷 B（EKB）作为淫羊藿中关键的异戊烯基黄酮类成分，此前已被发现可通过诱导肺癌细胞内质网应激促进类凋亡，或通过下调 STAT3 磷酸化水平抑制骨肉瘤进展，但 EKB 对 TNBC 的作用及具体分子机制尚未明确，尤其针对自噬流与溶酶体功能的调控作用仍缺乏系统研究。基于此，本研究通过体内外实验系统探究 EKB 对 TNBC 的调控效果，明确其是否通过靶向 MCOLN1/TRPML1 通道干扰自噬流，进而揭示 EKB 调控 TNBC 进展的分子机制，为 TNBC 的新型调控策略提供实验依据。
本研究选用的细胞模型包括人 TNBC 细胞系 MDA-MB-231 与小鼠 TNBC 细胞系 4T1；自噬抑制剂 3 - 甲基腺嘌呤（3-MA，货号 M2292）与溶酶体酸性抑制剂巴弗洛霉素 A1（BafA1，货号 M4953）购自 AbMole，上述试剂均以二甲基亚砜（DMSO）溶解制备 50 mM 储备液，-80℃分装保存，使用前以完全培养基稀释至目标浓度，确保 DMSO 终浓度≤0.1% 以避免细胞毒性。ECL 化学发光液购自 AbMole。
溶酶体 Ca²⁺水平检测实验中，将细胞以 2×10⁵个 / 孔接种于 6 孔板，贴壁 24 h 后按分组处理，随后用预热 PBS 洗涤 2 次，加入含 1 mg/mL Oregon Green 488 BAPTA-1 Dextran 的无血清 DMEM 培养基，37℃避光孵育 1 h；孵育结束后用 PBS 洗涤 3 次，更换新鲜完全培养基继续孵育 30 min 使探针充分平衡，收集细胞并重悬于 PBS 中，采用 BD FACScan 流式细胞仪在激发波长 488 nm、发射波长 520 nm 条件下检测荧光强度，以平均荧光强度（MFI）表示相对溶酶体 Ca²⁺水平。细胞活力检测采用 CCK-8 法：将细胞以 5×10³ 个 / 孔接种于 96 孔板，贴壁 24 h 后加入不同浓度 EKB，每组设 3 个复孔，37℃孵育 24 h 或 48 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8 试剂，继续孵育 2 h，使用 Leica 酶标仪检测 450 nm 处吸光度，计算细胞相对活力。EdU 增殖检测实验中，细胞以 2×10⁵个 / 孔接种于 12 孔板，贴壁 24 h 后加入 EKB 处理 24 h，随后加入 EdU 工作液 37℃孵育 2 h；4% 多聚甲醛固定 30 min，0.1% Triton X-100 透化 20 min，加入 Click-iT EdU 染色液避光孵育 30 min，Hoechst 33342 染核，Leica 荧光显微镜观察并计数 EdU 阳性细胞比例。
细胞凋亡检测采用 Annexin V-FITC/PI 双染法与 TUNEL 染色法：Annexin V-FITC/PI 双染中，细胞经 EKB 处理 24 h 后收集，冷 PBS 洗涤 2 次，重悬于 1× 结合缓冲液中，加入 5 μL Annexin V-FITC 与 5 μL PI，室温避光孵育 30 min，流式细胞仪检测凋亡率；TUNEL 染色中，细胞爬片经处理后，按试剂盒说明书加入 TdT 酶与荧光素标记的 dUTP，避光孵育 60 min，DAPI 染核，荧光显微镜观察凋亡细胞。ROS 检测包括胞内 H₂O₂与线粒体 O₂・-：H₂O₂检测中，细胞经处理后加入 10 μM DCFH-DA，37℃避光孵育 1 h，PBS 洗涤 2 次，流式细胞仪检测荧光强度；线粒体 O₂・- 检测中，细胞加入 5 μM MitoSOX™ Red 工作液，37℃避光孵育 30 min，PBS 洗涤 2 次，流式细胞仪在激发波长 510 nm、发射波长 580 nm 条件下检测。抗氧化酶活性检测中，收集处理后的细胞或肿瘤组织，冰浴下用 PBS 匀浆，12000×g 4℃离心 10 min 取上清，采用相应试剂盒检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、还原型谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性及丙二醛（MDA）含量，所有指标均以总蛋白浓度（BCA 法测定）标准化。
肿瘤免疫微环境分析：取原位模型小鼠肿瘤组织，置于 200 目滤网研磨，用 Mouse Tumor Infiltrating Lymphocyte Isolation Kit 分离肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）；TILs 用相应荧光标记抗体 室温避光染色 30 min，流式细胞仪检测 CD8⁺T 细胞、CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性 T 细胞（Treg）、CD11b⁺Gr-1⁺髓系抑制性细胞（MDSC）、CD11b⁺F4/80⁺CD86⁺M1 型巨噬细胞、CD11b⁺F4/80⁺CD206⁺M2 型巨噬细胞比例。组织学与 IHC 分析：肿瘤及脏器组织用 10% 中性福尔马林固定 24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制备 4 μm 切片；H&E 染色用于观察组织形态，IHC 染色用于检测 Ki67（增殖标志物）、LC3（自噬标志物）表达，具体流程为脱蜡水化、抗原修复、3% H₂O₂阻断内源性过氧化物酶、封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB 显色、苏木精复染、脱水透明、封片，Olympus 光学显微镜观察并定量分析阳性信号强度。所有实验均独立重复至少 3 次，数据以均值 ± 标准差（SD）表示，采用 SPSS 17.0 软件进行统计分析，两组比较采用独立样本 t 检验，多组比较采用单因素方差分析结合 Dunnett 多重比较，p<0.05 视为差异具有统计学意义。
EKB 对 TNBC 细胞增殖、迁移及凋亡的影响实验结果显示，CCK-8 检测表明，EKB 以时间（24 h、48 h）和剂量（0-40 μM）依赖性方式显著降低 MDA-MB-231 与 4T1 细胞活力，48 h 时 40 μM EKB 对两种细胞的活力抑制率分别达 68.3% 与 72.1%（p<0.001），提示 EKB 对 TNBC 细胞增殖具有强效抑制作用；Western blot 检测发现，EKB 处理后增殖标志物 PCNA 的蛋白水平显著下调，且呈剂量依赖性，进一步验证了其抗增殖效果。EdU 染色结果显示，随着 EKB 浓度升高，EdU 阳性细胞比例逐渐降低，20 μM EKB 处理后，MDA-MB-231 与 4T1 细胞的 EdU 阳性率分别从对照组的 45.2%、48.7% 降至 12.3%、10.5%（p<0.001），直接证实 EKB 可抑制 TNBC 细胞的 DNA 合成能力。Transwell 迁移实验表明，10 μM、20 μM、40 μM EKB 处理后，MDA-MB-231 细胞的迁移数分别较对照组减少 32.6%、58.4%、76.2%（p<0.05、p<0.01、p<0.001），4T1 细胞迁移数分别减少 29.8%、55.7%、73.9%（p<0.05、p<0.01、p<0.001），提示 EKB 可显著抑制 TNBC 细胞的迁移能力。
凋亡检测结果显示，Annexin V-FITC/PI 双染法发现 20 μM EKB 处理 24 h 后，MDA-MB-231 与 4T1 细胞的凋亡率分别从对照组的 3.2%、2.8% 升至 28.5%、31.7%（p<0.001）；TUNEL 染色观察到 EKB 处理组凋亡细胞数量显著增加，且细胞核浓缩、染色质边缘化等凋亡特征明显；TEM 观察发现 20 μM EKB 处理后的 4T1 细胞内出现大量凋亡小体，线粒体肿胀、嵴断裂，进一步证实 EKB 可诱导 TNBC 细胞凋亡。Western blot 分析显示，EKB 处理后促凋亡蛋白 Bax 与 Cleaved-caspase3 的表达水平显著上调，而抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达水平显著下调，且呈剂量依赖性，提示 EKB 可能通过调控 Bcl-2 家族蛋白与 caspase 凋亡通路诱导 TNBC 细胞凋亡。
为探究 EKB 调控 TNBC 进展的分子机制，对 EKB 处理后的 4T1 细胞进行 RNA-seq 分析，共筛选出 2936 个差异表达基因（|fold change|≥1.5，p<0.05），KEGG 通路富集分析发现自噬 - 溶酶体通路是显著富集的通路之一，GO 功能富集分析显示差异基因主要涉及 “自噬体形成”“溶酶体组织”“自噬流调控” 等生物学过程，提示 EKB 可能通过调控自噬流发挥作用。Western blot 检测自噬标志物发现，EKB 处理后 LC3-II 与 p62 的蛋白水平均显著上调，且呈剂量与时间依赖性，20 μM EKB 处理 24 h 后，4T1 细胞的 LC3-II/LC3-I 比值较对照组升高 3.2 倍（p<0.001），p62 水平升高 2.8 倍（p<0.001），提示 EKB 可能阻断自噬流导致自噬体积累。
为明确自噬流阻断的阶段，研究者采用 AbMole 的 3-MA（自噬起始抑制剂）与 BafA1（自噬晚期抑制剂，抑制溶酶体酸性）进行干预：预处理 3-MA 后，EKB 诱导的 LC3-II 上调被显著抑制，而预处理 BafA1 后，EKB 对 LC3-II 的上调作用无明显影响，反而 EKB 可拮抗 BafA1 诱导的 LC3-II 过度积累，表明 EKB 主要在自噬晚期阻断自噬流，即抑制自噬体与溶酶体融合。MDC 染色与免疫荧光实验显示，EKB 处理后自噬泡数量显著增加，LC3 puncta 数量较对照组升高 4.1 倍（p<0.001）；TEM 观察发现 EKB 处理后的 4T1 细胞内出现大量双层膜结构的自噬体，且自噬体与溶酶体融合形成的自噬溶酶体数量显著减少，进一步证实 EKB 可阻断自噬体 - 溶酶体融合。
为探究自噬流阻断与 EKB 诱导凋亡的关系，采用雷帕霉素（自噬诱导剂）预处理细胞，结果显示雷帕霉素可显著逆转 EKB 诱导的凋亡，20 μM EKB+100 nM 雷帕霉素组的凋亡率较 20 μM EKB 单独处理组降低 45.2%（p<0.001），Western blot 显示雷帕霉素可下调 EKB 诱导的 Bax 与 Cleaved-caspase3 表达，上调 Bcl-2 表达，提示 EKB 诱导的自噬流阻断可能通过促进凋亡发挥抑癌作用。进一步研究发现，EKB 处理后胞内 H₂O₂水平与线粒体 O₂・- 水平显著升高，20 μM EKB 处理 24 h 后，4T1 细胞的 DCFH-DA 荧光强度较对照组升高 3.6 倍（p<0.001），MitoSOX™ Red 荧光强度升高 3.2 倍（p<0.001）；同时，EKB 处理显著降低 GSH-Px、GSH、CAT、SOD 的活性，升高 MDA 含量，提示 EKB 可破坏细胞抗氧化系统，导致氧化应激积累。
Western blot 检测发现，EKB 处理后抗氧化通路关键分子 Keap1 表达上调，HO-1 表达下调，免疫荧光显示 Nrf2 核转位减少，提示 EKB 可能通过抑制 Nrf2/HO-1 通路削弱细胞抗氧化能力。雷帕霉素预处理可显著降低 EKB 诱导的 H₂O₂与线粒体 O₂・- 水平，恢复抗氧化酶活性，提示自噬流阻断是 EKB 诱导氧化应激的重要原因。采用 N - 乙酰半胱氨酸（NAC，ROS 清除剂）预处理细胞，结果显示 NAC 可显著逆转 EKB 诱导的凋亡，恢复抗氧化酶活性，进一步证实氧化应激是连接 EKB 诱导自噬流阻断与凋亡的关键介质。
为明确 EKB 调控自噬流的分子靶点，对 RNA-seq 中自噬 - 溶酶体通路的差异基因进行分析，发现 MCOLN1/TRPML1 的表达下调最为显著（fold change=0.32，p<0.001），且该通道与自噬体 - 溶酶体融合密切相关，因此推测 MCOLN1/TRPML1 可能是 EKB 的潜在靶点。分子对接结果显示，EKB 可与 MCOLN1/TRPML1 的活性口袋形成稳定结合，结合能为 - 8.7 kcal/mol，EKB 的羟基与 MCOLN1/TRPML1 的 Tyr-147、Asn-97 形成氢键，疏水基团与 Arg-146、Thr-239 形成疏水相互作用，提示二者存在直接结合能力。MD 模拟结果显示，EKB-MCOLN1/TRPML1 复合物在 100 ns 模拟过程中，RMSD 值稳定在 0.25-0.3 nm，Rg 值稳定在 1.92-1.98 nm，表明复合物结构稳定；RMSF 分析显示活性口袋周围氨基酸残基（Tyr-147、Thr-239、Arg-146、Asn-97）的波动较小（RMSF<0.3 nm），提示 EKB 结合后可稳定活性口袋构象；FEL 分析显示复合物在 Rg=1.91-1.97 nm、RMSD=0.40-0.45 nm 时能量最低，对应最稳定构象。CETSA 实验结果显示，EKB 处理后 MCOLN1/TRPML1 的热稳定性显著提高，在 56℃时，EKB 处理组的 MCOLN1/TRPML1 蛋白剩余量较对照组升高 2.7 倍（p<0.001），直接证实 EKB 可与 MCOLN1/TRPML1 在细胞内发生特异性结合。
为验证 MCOLN1/TRPML1 的功能意义，采用 ML-SI3（MCOLN1/TRPML1 特异性抑制剂）与 siRNA 沉默 MCOLN1 进行实验：ML-SI3 预处理可显著降低 EKB 对 TNBC 细胞的活力抑制率，20 μM EKB+1 μM ML-SI3 组的细胞活力较 20 μM EKB 单独处理组升高 38.6%（p<0.001）；Western blot 显示 ML-SI3 可逆转 EKB 诱导的 LC3-II 与 p62 上调，减少氧化应激积累，抑制凋亡相关蛋白的表达变化；siRNA 沉默 MCOLN1 后，EKB 对自噬流与凋亡的调控作用均显著减弱，进一步证实 EKB 通过靶向 MCOLN1/TRPML1 发挥作用。由于 MCOLN1/TRPML1 是溶酶体阳离子通道，研究者探究其介导的离子效应，采用不同离子螯合剂进行干预：Ca²⁺螯合剂 BAPTA 预处理可显著逆转 EKB 诱导的 LC3-II 上调，而 Zn²⁺螯合剂 TPEN 与 Fe²⁺螯合剂 DFX 无明显作用；溶酶体 Ca²⁺检测显示 EKB 处理后溶酶体 Ca²⁺水平显著降低，MFI 较对照组下降 42.3%（p<0.001），ML-SI3 预处理可部分恢复溶酶体 Ca²⁺水平，提示 EKB 通过激活 MCOLN1/TRPML1 促进溶酶体 Ca²⁺外流，进而阻断自噬流。进一步研究发现，EKB 处理可显著抑制自噬体膜蛋白 STX17 与溶酶体膜蛋白 VAMP8、SNAP29 的相互作用，Co-IP 实验显示 EKB 处理后 STX17-VAMP8、STX17-SNAP29 的结合量分别较对照组降低 62.3%、58.7%（p<0.001），而 BAPTA 预处理可恢复三者的相互作用；LysoTracker Red 染色显示 EKB 处理后溶酶体酸性显著降低，pH 值从对照组的 4.8 升至 6.2（p<0.001），BAPTA 预处理可部分恢复溶酶体酸性，提示 EKB 诱导的溶酶体 Ca²⁺外流可能通过破坏 SNARE 复合物形成与溶酶体酸性，抑制自噬体 - 溶酶体融合。
综上，本研究证实 EKB 可通过靶向 MCOLN1/TRPML1 通道促进溶酶体 Ca²⁺外流，一方面破坏 SNARE 复合物（STX17-VAMP8-SNAP29）的形成，抑制自噬体 - 溶酶体融合，另一方面降低溶酶体酸性，进一步阻断自噬流；自噬流阻断导致胞内氧化应激（H₂O₂、线粒体 O₂・-）积累，进而激活 caspase 凋亡通路诱导 TNBC 细胞凋亡；同时，EKB 可通过抑制 EMT 减少 TNBC 转移，并通过调节肿瘤免疫微环境增强抗瘤免疫应答。本研究不仅揭示了 EKB 调控 TNBC 进展的全新分子机制，还为 TNBC 的新型调控策略提供了实验依据，同时也为 MCOLN1/TRPML1 通道在肿瘤中的功能研究拓展了新方向。后续研究可进一步优化 EKB 的结构以提高其靶向性，或探索 EKB 与其他自噬抑制剂、免疫调节剂的联合应用，为 TNBC 的干预研究提供更多思路。