2025.06.06【Ribo-seq】|RiboCode：基于Ribo-seq数据的全基因组翻译ORF检测工具详解与实战流程

一、前言

大家好！今天我们要学习的是RiboCode——一个专为Ribo-seq（核糖体足迹测序）数据设计的高质量翻译ORF（开放阅读框）检测工具。RiboCode能够帮助我们在全基因组范围内精准识别翻译事件，发掘经典CDS之外的uORF、dORF、重叠ORF等新型翻译本，极大拓展了我们对转录本翻译潜能的认知。

---

二、RiboCode简介

RiboCode 是由清华大学杨学睿课题组开发的开源软件，支持Linux/Mac平台，采用Python实现。其核心优势在于：

• 自动化流程：一条命令即可完成注释准备、P-site定位、ORF预测。
• 高灵敏度与特异性：基于三碱基周期性和P-site富集，准确区分真实翻译事件。
• 多类型ORF检测：支持annotated、uORF、dORF、overlap、internal、novel等多种ORF类型。
• 结果可视化与下游分析支持：可输出GTF/BED格式，便于后续功能注释与可视化。

---

三、安装与依赖

RiboCode 支持多种安装方式，推荐使用conda或pip：

# 使用conda
conda install -c bioconda ribocode# 或者使用pip
pip install ribocode

主要依赖包：pysam、pyfasta、h5py、Biopython、numpy、scipy、statsmodels、matplotlib、HTSeq、minepy

---

四、分析流程总览

RiboCode的标准分析流程分为以下几个主要步骤：

1. 数据准备

• 基因组FASTA（如：GRCh38.p13_genomic.fna）
• 注释GTF（如：GRCh38.p13_genomic.gtf）
• Ribo-seq比对BAM（必须是比对到转录本的BAM，推荐用STAR的--quantMode TranscriptomeSAM参数生成）

2. 一步法命令（推荐）

RiboCode支持一步法自动完成全部流程：

RiboCode_onestep -g <annotation.gtf> -f <genome.fa> -r <Aligned.toTranscriptome.out.bam> -l no -o <output_prefix>

参数说明：

• -g：GTF注释文件
• -f：基因组FASTA文件
• -r：转录本比对BAM文件
• -l no：自动判定起始密码子
• -o：输出前缀

注意：BAM文件的reference name（即转录本ID）必须与GTF注释中的transcript_id完全一致，否则会报错！

3. 分步执行（进阶）

如果需要自定义每一步，可以分步运行：

1. 准备转录本注释

   prepare_transcripts -g <annotation.gtf> -f <genome.fa> -o <RiboCode_annot>
   

2. P-site定位与周期性分析

   metaplots -a <RiboCode_annot> -r <Aligned.toTranscriptome.out.bam>
   

3. ORF预测

   RiboCode -a <RiboCode_annot> -c <config.txt> -l no -g -o <output_prefix>
   

---

五、结果解读

RiboCode会输出如下主要结果文件：

• <output_prefix>.txt：每个转录本的所有预测ORF信息
• <output_prefix>_collapsed.txt：合并不同转录本中终止密码子相同的ORF
• <output_prefix>.gtf/.bed：可选，预测ORF的注释文件（加-outgtf/-outbed参数）

主要字段说明：

• ORF_ID：ORF编号
• ORF_type：ORF类型（annotated、uORF、dORF、overlap、internal、novel等）
• ORF_tstart/ORF_tstop：转录本坐标
• ORF_gstart/ORF_gstop：基因组坐标
• pval_frame0_vs_frame1/2：三帧周期性统计显著性
• adjusted_pval：多重校正后p值

---

六、可视化与下游分析

1. 绘制ORF的P-site密度图

plot_orf_density -a <RiboCode_annot> -c <config.txt> -t <transcript_id> -s <ORF_gstart> -e <ORF_gstop> -o <output.pdf>

2. 统计ORF上的RPF reads数

ORFcount -g <output_prefix>.gtf -r <ribo-seq.bam> -f 15 -l 5 -e 100 -m 26 -M 34 -o <ORF.counts>

---

七、常见问题与注意事项

1. BAM文件必须是转录本比对，且ID与注释一致。
2. GTF和FASTA必须配套，不要混用不同来源或版本。
3. 报错KeyError多为ID不一致或注释缺失。
4. 可用samtools sort对BAM排序，但RiboCode支持unsorted BAM。

---

八、实战经验与建议

• 建议用STAR比对并加--quantMode TranscriptomeSAM参数，这样能直接生成RiboCode可用的BAM文件。
• 分析流程可用Snakemake等流程管理工具自动化，提升效率和可重复性。
• 结果可结合RiboTaper、RiboWave等工具交叉验证，提升发现的可靠性。

---

九、参考资料

• RiboCode官方文档
• RiboCode使用教程（CSDN） （可参考社区经验）

---

十、结语

RiboCode是Ribo-seq数据分析领域的利器，掌握其原理和流程，将极大提升你在转录组与翻译组学领域的研究能力。希望大家多动手实践，遇到问题及时查阅官方文档和社区经验，祝大家科研顺利！

---