1小时检测cAMP的武功秘籍

环磷酸腺苷（cAMP）是G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导中重要的细胞内第二信使。其浓度的动态变化可反映GPCR激动剂或拮抗剂的活性，是药物筛选和基础研究的重要指标。然而，传统的cAMP检测方法常面临灵敏度低、信噪比高、步骤繁琐或通量受限等问题。

图1、Gs、Gq、Gi 和 arrestin 下游通路的串扰

THUNDER™ cAMP TR-FRET检测试剂盒基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）技术，以高灵敏度、无需洗涤的均相检测流程，为研究人员提供了一种快速、稳定的解决方案，尤其适用于高通量筛选和GPCR药理学研究。

一、THUNDER™技术原理及独特优势
THUNDER™试剂盒的核心原理是竞争性免疫检测：

图2、THUNDER™ cAMP检测原理示意图

1、双荧光标记系统：
供体：铕螯合物标记的链霉亲和素（Eu-SA）与生物素化cAMP（Biotin-cAMP）形成复合物。受体：远红荧光标记的抗cAMP单克隆抗体（FR-anti-cAMP）。

2、竞争结合机制：
当样本中无游离cAMP时，FR-anti-cAMP抗体与Eu-SA/Biotin-cAMP复合物结合，触发TR-FRET信号（665nm）。样本中cAMP含量越高，竞争性结合抗体，导致TR-FRET信号减弱。

3、快速定量cAMP：实验仅需1小时，即可获取准确读值。
4、信号稳定：室温下信号可稳定18小时或更长时间，支持灵活的实验时间安排。
5、适用范围广泛：同时适用Gs和Gi转导的cAMP检测。

二、实验攻略：提升检测灵敏度和重复性

1、细胞密度调整
推荐细胞密度选择范围：1,000–10,000细胞/孔（以384孔板为例），如细胞表达量比较低，可增加细胞密度。
优化方法：通过交叉滴定实验（如Forskolin浓度梯度与不同细胞密度组合），选择信号背景比（S/B）最高且响应值位于标准曲线范围的密度。如下图示例，左图：cAMP标准曲线，右图：细胞与Forskolin交叉滴定。获得的Forskolin浓度反应曲线显示，每孔4,000个细胞可使反应落在cAMP标曲范围内，同时使测定的窗口达到最大。故示例中细胞密度选择4,000细胞/孔。

图3、最佳细胞密度选择示意图。

2.关键试剂如何选择
IBMX：推荐0.5mM（抑制磷酸二酯酶活性，避免cAMP降解）。IBMX对化合物效力的影响和最佳浓度应根据所使用的测定和细胞模型来确定。

Forskolin：使用其EC50浓度，通过预实验确定，确保信号位于标准曲线线性区间。

激动剂/拮抗剂：根据EC50或IC50值选择浓度，避免超出标准曲线动态范围。

3、孵育条件
刺激时间：推荐30分钟（室温或37°C），可通过15–60分钟梯度实验优化。
检测孵育：室温1小时即可读数，延长至18小时不影响信号稳定性。

三、标准曲线制备与数据计算方法

1、标准曲线制备
①梯度稀释：
使用试剂盒提供的50μM cAMP标准品，按说明书进行10倍系列稀释（10个梯度，范围3×10-11–3×10-7）。每个浓度需设复孔（推荐三重复）。
②数据拟合：
使用4参数逻辑方程（4PL）拟合标准曲线，（sigmoidal dose-response curve）和1/Y2数据加权，分析数据以创建cAMP标准曲线。通过比值Ratio（665nm/615nm×1,000）计算cAMP浓度。

2、样本定量
将实验样本的TR-FRET信号代入标准曲线方程，转换为cAMP浓度。

四、应用案例介绍
在表达内源性Gs蛋白偶联腺苷酸A2a受体的U266B1细胞（每孔2,000个细胞）中激动剂浓度-反应曲线。图4A、实验同时安排cAMP标准曲线绘制，以及激动剂NECA检测，反应以Ratio值绘制（纵坐标），测定EC50为16.7nM。此时，NECA产生的信号位于标准曲线的定量范围之内。图4B、以cAMP浓度为纵坐标，NECA浓度为横坐标绘制激动剂反应曲线，并计算EC50为122nM。图4C、以激动百分比作为纵坐标和NECA为横坐标来绘制反应曲线，NECA EC50为122nM。

图4、表达内源性Gs蛋白偶联腺苷酸A2a受体的U266B1细胞 cAMP检测

在表达表达Gi蛋白偶联人OP3受体的CHO细胞（每孔2,500个细胞）中激动剂浓度反应曲线。图5A、实验同时安排cAMP标准曲线绘制，以及激动剂DAMGO检测，反应以Ratio值绘制（纵坐标），测定EC50为7nM。此时DAMGO产生的信号位于标准曲线的定量范围之内。图5B、以cAMP浓度为纵坐标，DAMGO浓度为横坐标绘制激动剂反应曲线，计算EC50为3nM。图5C、以激动百分比作为纵坐标和NECA为横坐标来绘制反应曲线，DAMGO EC50为3nM。

图5、在表达Gi蛋白偶联人OP3受体的CHO细胞cAMP检测