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从人类多能干细胞生成心脏形成类器官Protocol

news 2025/10/9 8:09:19

培养基与添加物

B27 添加剂（含胰岛素）
B27 添加剂（不含胰岛素）
DMEM/F12 培养基
Essential 8（E8）培养基（参见“试剂配制”部分）
KnockOut 血清替代物
RPMI 1640 培养基

酶、化学品与试剂

抗坏血酸-2-磷酸
碱性成纤维细胞生长因子
胰岛素
碳酸氢钠（NaHCO₃）
亚硒酸钠（Na₂SeO₃）
转化生长因子 β（TGF-β）
转铁蛋白
Accutase
二甲基亚砜（DMSO）
PBS（不含 Ca²⁺/Mg²⁺，10×）
纯水
青霉素/链霉素
台盼蓝溶液
CHIR99021（12 mM 储液，工作浓度 7.5 μM）
IWP2（10 mM 储液，工作浓度 5 μM）
Y27632（Rho 激酶抑制剂，10 mM 储液，工作浓度 10 μM）
Matrigel（基底膜基质，蛋白浓度 9.7–10.7 mg/mL）
Geltrex（低生长因子基底膜基质）

抗体（直接标记）

抗 CD31-APC（工作稀释比例 1:20）
抗 cTnT-VioBlue（工作稀释比例 1:50）

抗体（一抗）

抗 CD31（工作稀释比例 1:20）
抗 cTnT（工作稀释比例 1:200）
抗 HNF4α（工作稀释比例 1:100）
抗（泛）肌球蛋白重链 MF20（工作稀释比例 1:10）
抗 SOX2（工作稀释比例 1:200）
抗 SOX17（工作稀释比例 1:200）
抗波形蛋白（Vimentin，工作稀释比例 1:500）

抗体（二抗）

Cy3 标记驴抗小鼠 IgG（工作稀释比例 1:200）
Cy3 标记驴抗兔 IgG（工作稀释比例 1:200）
Cy3 标记驴抗山羊 IgG（工作稀释比例 1:200）
Alexa Fluor 488 标记驴抗兔 IgG（工作稀释比例 1:500）
Alexa Fluor 488 标记驴抗山羊 IgG（工作稀释比例 1:500）
HRP 标记山羊抗小鼠 IgG（工作稀释比例 1:500）

其他试剂

牛血清白蛋白（BSA）
DAPI（工作浓度：整体染色 0.57 μg/mL，切片染色 1.7 μg/mL）
Fix & Perm 试剂盒（用于固定与通透化）
STEMdiff 心肌细胞解离试剂盒
TSA Plus Cyanine 3（工作稀释比例 1:50）

耗材

15 mL 锥形管
T25 培养瓶
96 孔 U 型超低吸附培养板
96 孔 V 型培养板
多孔板封膜（醋酸材质，自粘）
血球计数板（Neubauer 改良型）
移液器（2–20 μL、10–100 μL、20–200 μL、100–1000 μL）
移液器吸头（0.1–10 μL，非无菌）
无菌剪刀（180°C 烘烤至少 3 小时）

仪器

离心机（300 g，4°C）
流式细胞仪
37°C、5% CO₂ 培养箱
荧光显微镜
倒置显微镜
恒温混匀仪（Thermomixer）

试剂配制（Reagent Setup）

所有储液建议分装保存，避免反复冻融；工作液建议现配现用。

CHIR99021 储液（12 mM）
- 10 mg CHIR99021 溶于 1.79 mL DMSO，60°C 水浴助溶。
- 分装后 −20°C 避光保存，最长 1 年。
- 工作液：0.625 μL 储液 + 1 mL 培养基 → 7.5 μM。
- 注意：CHIR99021 有光敏性，配制时关闭照明；有毒，戴手套与护目镜。
IWP2 储液（10 mM）
- 10 mg IWP2 溶于 2.17 mL DMSO，60°C 水浴助溶。
- 分装后 −20°C 保存，最长 1 年。
- 工作液：0.5 μL 储液 + 1 mL 培养基 → 5 μM。
Y27632 储液（10 mM）
- 50 mg Y27632 溶于 15.6 mL 纯水，过滤除菌。
- 分装后 −20°C 保存，最长 3 个月。
- 工作液：1 μL 储液 + 1 mL 培养基 → 10 μM。
- 注意：有毒，戴手套与护目镜。
Geltrex
- 4°C 冰上隔夜解冻，分装 125 μL/管，−80°C 保存。
- 避免反复冻融。
Matrigel
- 4°C 冰上隔夜解冻，分装后 −80°C 保存。
- 避免反复冻融。
E8 培养基
- 基础液：DMEM/F12 + 543 mg/L NaHCO₃，用 NaOH 调 pH 至 7.4，4°C 可存 1 年。
- 工作液：基础液中依次加入：
  – 64 mg/L 抗坏血酸-2-磷酸
  – 100 μg/L bFGF
  – 20 mg/L 胰岛素
  – 14 μg/L Na₂SeO₃
  – 10.7 mg/L 转铁蛋白
  – 2 μg/L TGF-β
  – 可选：1% 青霉素/链霉素
- 4°C 可存 1 个月。
RB− 培养基（用于第 0–5 天）
- 50 mL RPMI 1640 + 1 mL B27（无胰岛素），4°C 可存 1 个月。
- 可选：1% 青霉素/链霉素。
RB+ 培养基（用于第 7 天及以后）
- 50 mL RPMI 1640 + 1 mL B27（含胰岛素），4°C 可存 1 个月。
- 可选：1% 青霉素/链霉素。
PBS w/o（1×，无 Ca²⁺/Mg²⁺）
- 10× PBS 50 mL + 纯水 450 mL，室温可存 2 年。
台盼蓝稀释液
- 台盼蓝储液 1:10 用 PBS w/o 稀释。
- 注意：有害，避免接触与吸入。
流式缓冲液
- 0.5 g BSA + 100 mL PBS w/o，磁力搅拌溶解，4°C 可存 1 个月。
固定液（现配现用）
- 流式缓冲液 : Fix & Perm A 液 = 1 : 1（体积比）。
- 含多聚甲醛，有害，通风橱内操作，戴防护装备。
STEMdiff 心肌细胞解离液
- 1 mL 分装，−20°C 保存，避免反复冻融。
- 注意：有害，避免接触与吸入。
STEMdiff 心肌细胞支持液
- 5 mL 分装，−20°C 保存，避免反复冻融。

设备准备（Equipment Setup）

1. Geltrex 包被 T25 培养瓶

将 125 μL Geltrex 加入 50 mL 冷 DMEM/F12（4 °C）中混匀。
每瓶加 5 mL 混合液，37 °C 孵育 1 h。
4 °C 可保存 4 周；使用前吸去包被液即可。

实验步骤（Procedure）

以下时间以“同时制备 36 个 HFO（3 行 96 孔板）”为例。
所有孵育条件：37 °C、5 % CO₂、饱和湿度，除非特别说明。
关键步骤已标为“CRITICAL STEP”，建议首次操作前完整阅读并做预实验。

A. 二维 hPSC 单层培养启动

（可选 A：从 MEF 上细胞开始；可选 B：从冻存单层细胞开始）

A. 从 MEF 上 hPSC 开始

取 1 孔 80 % 汇合的 hPSC（6 孔板，MEF 饲养层）。
PBS w/o 洗 1 次，加 500 μL Accutase，37 °C 3 min。
加 3 mL DMEM/F12 吹打成单细胞，移入 15 mL 管。
300 g，4 °C 离心 3 min。
去上清，1 mL E8 + 10 μM Y27632 重悬。
取 1 个已包被 Geltrex 的 T25，加 4 mL E8 + Y27632。
将细胞悬液转入 T25，水平十字摇匀后入孵箱。
2 d 后换液，以后每日换 5 mL E8（无需 Y27632）。
3–4 d 达 80–90 % 汇合时传代（见下“传代”部分）。

B. 从冻存单层 hPSC 开始

冻存管（约 3 × 10⁶ 细胞）37 °C 速融，移入 10 mL 冷 DMEM/F12。
300 g，4 °C 离心 3 min。
去上清，1 mL E8 + 10 μM Y27632 重悬。
其余步骤同 A.6–A.9。

B. hPSC 单层传代（每 3–4 d 一次）

吸去培养液，PBS w/o 洗 1 次。
加 1 mL Accutase，37 °C 3 min（忌超时）。
加 5 mL DMEM/F12 吹打脱壁，移入 15 mL 管。
300 g，4 °C 离心 3 min。
去上清，1 mL E8 + 10 μM Y27632 重悬。
计数并台盼蓝测活率。
取 0.5–1.0 × 10⁶ 细胞/瓶，接种于新 Geltrex T25，加 5 mL E8 + Y27632。
2 d 后每日换 E8（无 Y27632）。
3–4 d 后再传代，循环进行。

关键要求：

曾用 MEF 培养的细胞需 ≥ 4 代纯化去 MEF。
冻存来源细胞需 ≥ 2 代恢复。
单层总传代 ≤ 8 代；定期检 pluripotency、核型、支原体。

D. 换液操作细则（以 96 孔板为例）

目标： 完全移除旧液而不损伤 Matrigel 滴。

方法 A（标准枪头）

板倾斜 45°，用 1000 μL 枪头沿壁吸去液面以上培养液。
换 20–200 μL 枪头，轻压 Matrigel 滴使其贴壁，沿壁半圈吸净残余液体。

方法 B（叠枪头）

20–200 μL 枪头前端再套一截 10 μL 小枪头（已灭菌），利用细口吸液，减少吸力面。

共同要求：

吸液时只按至第一档，忌带入气泡。
加液时亦按至第一档，沿壁缓慢注入，忌直接冲击滴体。

E. HFO 收集与转移（Day 10 及以后）

用剪刀将 100–1000 μL 枪头斜口剪平（90°），内径略大于 HFO。
板倾斜 45°，枪头垂直贴底，轻吸即可将 HFO 完整取出。
可转移至 12 孔悬浮培养板继续长期培养（RB+，每 2–3 d 换液，最长再养 2 周）。

F. HFO 解离与染色（96 孔版流程，2 h 完成）

将 HFO 转入 V 底 96 孔板，去培养液，PBS w/o 洗 1 次。
每孔加 100 μL STEMdiff 心肌细胞解离液，封膜后 37 °C、1000 rpm 震荡 12 min（d10–d22 样本 12–15 min 可调）。
多通道枪头吹打 ≤ 1 min 至单细胞。
加 100 μL 流式缓冲液中止，300 g 3 min 去上清。
固定液（Fix & Perm A）重悬，室温 10 min 精确计时。
缓冲液洗 2 次后，用 Perm B 稀释抗体（例：cTnT-VioBlue 1:50 + CD31-APC 1:20），室温避光 30 min。
缓冲液洗 2 次，重悬于 100 μL 缓冲液，4 °C 避光可存 2 d 内上机。