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生物化学Learning Track（13）核酸的性质和研究方法

news 2025/10/5 9:24:23

（本笔记基于杨荣武教授主编的《生物化学》第四版，如有未说明来源的配图也源于教材）

核酸的性质

核酸的性质一部分来源于组成核酸基本单位核苷酸的性质，一部分来源于其二级结构的性质

手性

因为戊糖具有手性，所以核酸也具有手性，那么具有手性也就具备了旋光性

紫外吸收

由于碱基上存在着嘧啶和咪唑环，这些环都具有芳香性，所以可以在紫外280nm处有较强吸收，所以核酸在此波长处也有吸收峰

两性解离

由于核酸不仅有带有碱性的含氮碱基还有带有酸性的磷酸基团，所以核酸可以进行两性解离。DNA的pI为4-4.5，RNA的pI为2-2.5，此差别更多是因为核糖的2'位有羟基可以稀释负电性，同时DNA的磷酸基团解离受到对应链的静电排斥效果更强，所以能量更高

黏度

对于结构细长同时具备一定刚性的大分子而言，其黏度越好。那么对于双螺旋的DNA而言，正好满足条件，所以dsDNA的黏度很好，但是对于ssDNA和单链RNA而言，黏度有所下降

沉淀

在一定盐浓度下，核酸可以被极性有机溶剂沉淀（如无水乙醇）。这是因为，在盐阳离子的作用下，磷酸基团吸附正电粒子，使得其负电性降低，核酸分子之间的静电排斥作用下降，所以有益于核酸分子的彼此靠近。同时极性溶剂如乙醇的加入，可以竞争核酸分子水化层的水分子，同时参与构成核酸分子表面的溶剂层，使得溶剂层的结构齐整度下降，这也有利于核酸分子彼此靠近沉淀

变性

核酸的变性是指在特定因素的作用下，其双螺旋区因为氢键和碱基堆积力的破坏而发生的解链过程。核酸的变性可以是局部的，也可以发生在整个核酸分子上。

导致核酸发生变性的因素可以有很多种，凡是可以破坏稳定双螺旋构象作用的比如碱基堆积力和氢键，已经增强双螺旋结构不稳定因素的，都可以成为变性的原因

加热可以增大碱基的热运动的强度，从而使得氢键和碱基堆积力不再稳定；降低盐浓度可以使得磷酸脱氧核糖骨架之间发生更大的静电排斥；提高pH可以使得碱基更容易发生异构，从而破坏现有氢键结构；加入有机试剂，如乙醇甲醇尿素等，一方面可以竞争氢键的供体和受体，另一方面其疏水基团可以插入碱基平面之间，破坏碱基堆积力的作用。最常用的DNA变性的方法是碱变性和热变性，但是热变性可能会导致磷酸二酯键的断裂，所以碱变性的优越性更加突出。

变性可以导致核酸性质的变化，一方面可以降低黏度（dsDNA->ssDNA强度下降）、增大紫外吸收（增色效应，由于碱基更多暴露出来，吸收能力加强）、增大浮力密度（因为单链DNA可以形成链内氢键，使得其结构更加紧凑），旋光度变化等。对于其生物学功能而言，如果其生物学功能体现在其一级结构如DNA、mRNA等，那么变性不会影响到其生物功能，但是如果其生物学功能与其高级结构有关比如tRNA、rRNA等，那么就会对生物功能产生影响。

另外，如果我们单独去研究双螺旋DNA的热变性，可以发现是在很窄的温度内发生的（可以用紫外吸收强度来判断，因为增色效应）。这个区间的宽窄与DNA的均一性有关，这均一性体现在两个方面，一方面是DNA序列的均一性，也就是如果DNA是多聚核苷酸，那么各个碱基所处化学环境基本一致，那么热变性的温度区间也会很窄；另一方面是DNA组成是否是均一的，如果DNA组成不均一，那么一个区间实际上是多个DNA解旋的综合结果。

同时我们可以用Tm来表示增色效应达到一半的温度（也就是有一半的碱基解旋时候的温度），Tm可以受到GC含量的影响（因为GC是形成三键甚至可以总结出经验规律，GC百分比和Tm呈现出一个线性关系），离子强度（如果离子强度越大，那么磷酸链之间排斥作用就越弱），双螺旋的长度（双螺旋越长，那么碱基堆叠力也就越大，需要解离的碱基也就越多才可以到达Tm）

我们在之前提到过有助于变性的因素也可以降低Tm

复性

当各种变性因素不存在的时候，变性时解开的互补单链全部或者部分恢复到天然双螺旋结构的现象称之为复性。热变性的DNA一般在缓慢冷却之后就可以复性，这个过程称之为退火。那么复性所带来的核酸性质变化就和变形恰好相反（增色效应的反效应的名字是减色效应）

那么影响DNA复性因素其实也基本上是和变性相反的，但是也存在着不同，最大的不同体现在温度和DNA序列的复杂度上。

为什么会产生不同呢？因为DNA变性是将一个有序的结构变为相对无序，而复性是将一个相对无序的结构变为有序。我们对于无序的创造是简单的，我们只需要升高温度即可，但是我们重新建立有序的结构却不能仅仅简单降低温度。

一方面我们不能仍然保持较高温度，此时DNA仍然有变性的趋势，另一方面我们也不能将温度降到过低，否则DNA链的热运动首先，两条链之间碰撞可能性下降，同时链的柔性下降，形成双螺旋的难度上升。所以我们对温度进行适当的把控。一般我们认为Tm一下25℃是复性的最佳稳定，同时复性的温度也应该缓慢下降，如果迅速冷却到低温复性是不可能的（原因就是热运动+柔性双急剧下降）

那么之所以DNA复性温度需要把控，这是因为DNA的变性和复性恰好是近乎相反的过程，DNA的变性是从某一个碱基开始解螺旋，那么后面的碱基类似于解开拉链一般，DNA的复性也是如此，不过是需要两个单链分子之间的接触来启动部分的互补碱基配对形成核（我们称之为“成核反应”），随后成核的碱基经过小范围重排，单链的其他区域像拉拉链一样复性。在前一个成核部分，我们要求一定的热运动，在后一个拉拉链部分我们需要一定的柔性，这就是我们需要对温度进行适当把控的原因）

同时影响复性的难易的还有DNA序列的复杂度或者是均一性，那么如果复杂度越低，那么成核也就越简单。在核酸复性动力学当中，引入了Cot的术语，用来描述DNA序列对复性速率的影响，其中Co是单链DNA的起始浓度，t是以s为单位的时间，Cot就是作为一个整体的自变量来考虑，比如起始浓度是2，反应时间是100s和起始浓度是1，反应时间是200s的复性结果是一样的。同时我们也定义核酸分子的复杂度即非重复碱基对数目，或者说简单一点就是从第几个碱基开始重复，那么就是起始到该碱基前一位。比如ATATAT的核酸分子复杂度就是2。那么我们类比于Tm的定义，我们将复性率达到0.5的时候的Cot称为Cot1/2，这个和DNA的序列复杂度是呈正比的

（DNA浓度越高，那么DNA单链分子之间碰撞的几率也会越高，复性概率也就越大，这一点其实在Cot当中也有体现了）

杂交

核酸杂交是指利用核酸分子容易变性和复性的性质，将来源不同的核酸片段先变性然后再复性，就可以得到部分异源双链，这异源双链可以在单链DNA之间形成，也可以在DNA和RNA之间形成。

水解

和蛋白质一样，酸碱和酶均可以导致核酸水解。

在核酸分子内的糖苷键和磷酸二酯键对酸的敏感度是不一样的，糖苷键对酸的敏感度会大于磷酸酯键，所以在酸水解下，我们很难得到完成的核苷酸。同时嘌呤的糖苷键对酸的敏感性会大于嘧啶糖苷键，所以在酸水解下，嘌呤会最先脱落。

DNA对碱水解的耐受力是要高于酸，但是因为RNA的核糖的2'位的羟基使得其容易受到氢氧根的作用而发生去质子化，从而攻击磷酸二酯键脱去，所以在碱溶液下RNA十分容易水解。

当然效率最高的是酶水解，同样根据水解位点可以分为内切酶和外切酶，除此之外还可以将外切酶进一步分为5'和3'外切酶。

核酸的研究方法

核酸的分离、纯化和定量

（一）核酸的抽取

首先，我们在核酸的性质一节提到过，核酸很少是以游离态的形式存在的，所以在细胞当中，我们提取核酸，其实我们应该首先提取的是核蛋白。那么RNA是以核糖核蛋白的形式存在，DNA是以脱氧核蛋白的形式存在，既然是蛋白质，我们可以利用其在不同浓度盐溶液的溶解度差异来实现分离，也即是我们在之前讲到过的蛋白质提纯方法之一。一般，我们常用0.14mol/L的NaCl溶液抽取核糖蛋白和利用1mol/L抽提脱氧核蛋白（核蛋白是在滤液中）

然后我们得到核蛋白之后就需要去除蛋白质。有两种方法可以去除蛋白质，一种是利用蛋白酶K的酶解，一种是酚/氯仿的多次抽提，在抽取之前，我们可以先用RNA酶消化去除残留的RNA（对于DNA抽取，同理RNA）。在酚/氯仿抽取当中，极性强的核酸溶解在上层谁卖你，而变性的蛋白质处于两相的界面处。

最后我们可以将核酸进行沉淀，用到我们之前讲到的一定盐浓度（高盐），和一定的与水互溶的有机溶剂如无水乙醇来破坏溶剂层，使得核酸彼此靠近沉聚。

（二）电泳

在我们得到DNA之后，这通常是多个片段混合的DNA，所以我们可以用电泳的方式利用DNA的电性将DNA分离，一般我们选择琼脂糖凝胶电泳，同时用溴乙锭（EB）或者是凝胶红等物质将DNA染色，使得DNA可以在紫外光下显色。这也是我们进行DNA长度检测的常用方法。

（三）离心

我们也可以利用不同分子的分子量不同进而沉降系数不同来用离心的方式进行初步分离和后续的高纯度DNA的提取。

我们用到我们上次介绍的平衡密度离心，RNA密度最高位于管底，蛋白质最轻位于上方，DNA位于两者之间的某个位置。同样我们也可以利用不同分子量的DNA的沉降系数不同而对DNA进行进一步纯化。

（四）层析

我们在纯化蛋白质时介绍的层析纯化的方式也可以用于核酸的纯化

（五）核酸纯度的检测和定量

我们一般检测核酸的纯度和含量利用紫外分光光度法，通过测定 $OD_{260}/OD_{280}$ 的比值来推测浓度。在260nm处是DNA和RNA的吸收峰，在280nm处是蛋白质的吸收峰，所以我们可以根据比值判定样品的纯度。对于纯DNA而言，

对于DNA而言， $OD_{260}/OD_{280}$ ≈1.8，如果结果大于1.9，那么表明可能有RNA污染（因为RNA是单链，所以结果可能偏高），如果结果小于1.6，那么可能有蛋白质污染，对于纯RNA而言，1.7< $OD_{260}/OD_{280}$ <2.0。

对于纯DNA而言，一个 $OD_{260}$ 相当于50微克每毫升dsDNA或者是35微克每毫升ssDNA，对于纯RNA来说，1个 $OD_{260}$ 相当于40μg每毫升的RNA

核酸一级结构的测定

我们在这里主要介绍DNA一级结构的测定，对于RNA可以逆转录为DNA，然后进行测序。同时小编在这里介绍主要是原理部分，至于操作细节可以见书或者实验手册。

（1）末端终止法

末端终止法的巧妙之处在于利用了ddNTP，也就是双脱氧核苷酸（2'和3'），这样当这样的ddNTP连接在合成的子链的时候，那么子链就没有办法继续延伸了，我们就可以通过研究子链的长度来对碱基进行测定。这个测定方法有个前提，就是对于电泳的精度要求很高，因为我们的差距是一个bp，电泳结果必须可以显示在如此小的长度差异下的分辨结果。

那么具体步骤如下，我们同时进行四个反应体系的构建，每一个反应体系加入某一种ddNTP和四种dNTP，同时应当要保证ddNTP需要适量（后面介绍原因）然后，在各个反应体系中，DNA子链开始延伸，如果选择的是正常的dNTP则继续延伸，如果选择是我们加入的ddNTP，那么该子链的延伸到此结束，但是其他子链可能仍然选择了dNTP所以继续延伸下去。最后我们可以得到在不同位点终止延伸的子链，这些终点都是我们加入的ddNTP的碱基，我们就可以根据长度来判断对应碱基序列的。那么回到为什么要保证ddNTP适量，原因很简单，如果我们加入的过多，那么绝大多数的子链都在开始的几个碱基停止，而后面的碱基测序就很难进行。

（2）化学断裂法

化学断裂法不涉及子链的合成，而是直接在DNA上进行化学修饰使得特定碱基位点处断裂，然后我们就可以知道该位点是什么碱基了。这个方法的前提仍然是有好的电泳精度，同时还需要保证有特异性的试剂或者反应条件使得在特定碱基或者特定类碱基断裂。

同样我们也需要四个反应体系，如果理想的情况下，我们是希望可以做到找到4种不同的试剂来分别断裂特定碱基处的磷酸二酯键，然后我们只需要在DNA链的一端放射性修饰磷酸基团以定向，我们就可以在四个反应体系中分别得到各个碱基的位点信息。但是实际上的化学断裂法是AG，GG，CT和C四种断裂试剂，但是原理是一样的，具体试剂和条件可以见书。

（3）DNA序列分析的自动化

其实这个基本原理仍然建立在末端终止法，但是我们可以在末端终止法的基础上加上荧光标记（对于不同的ddNTP加上不同荧光标识），然后将我们获得的四个平行样本同时电泳，先停止的子链电泳速率更快，那么我们可以在某一个位点处设置一个光电检测管，根据子链通过时候的荧光标识和先后到达的情况，自动检测出序列。

后面这一部分测序方法采用了高通量的手段，所以称为下一代测序

（4）焦磷酸测序

焦磷酸测序的原理有点像Illumina测序（这里不会介绍），但是会更加简单。首先焦磷酸测序会首先将测序的DNA打成单链片段，然后固定在一个珠子上，固定之后进行PCR扩增以提高后续检测的荧光强度。（注意由于PCR，dNTP配对的是互补链而不是原链，所以最后反映出的序列就恰好是原链的）之后我们将珠子固定在平板的小孔上，焦磷酸测序的关键点在与利用了dNTP结合的时候释放出来的焦磷酸，然后利用一系列酶促反应来荧光显示焦磷酸的释放。用到的试剂有DNA聚合酶（当然得有啦），ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶，反应底物除了各种dNTP（的ATP用dATPαS代替，但是后面仍然直接称呼为dNTP哈）之外还有腺苷-5’-磷酸硫酸（APS）和荧光素。

那么首先向我们制备好的平板加入某一种dNTP，然后如果该碱基恰好是某些片段的位点的互补碱基，那么就会在DNA聚合酶的作用连接上去同时释放出焦磷酸，这个焦磷酸会在ATP硫酸化酶的作用下与APS反应形成ATP，然后ATP会在荧光素酶的作用下和荧光素反应发出荧光，那么我们就可以判定在发出荧光就是该碱基连接的位点。那么在这一轮反应结束之后，我们会去用双磷酸酶降解残留的ATP和剩余的dNTP，进行下一轮反应。

因为这里涉及到了配位，所以我们可以去研究DNA甲基化的情况，我们可以用亚硫酸盐处理原始样品，将没有甲基化的C变为U，而甲基化的C不会受到影响，那么在这一次结果当中，甲基化的C就是被T替代，所以根据差异碱基就可以得到甲基化位点（C->U->A->T）

（5）离子流测序

这种测序方式是利用了dNTP连接时会释放出质子进行的，我们会在半导体芯片的微孔当中固定DNA单链，然后通过某一种dNTP溶液，如果恰好配对，那么就会释放出质子，离子传感器可以检测pH变化然后实现对于碱基的判读。如果有连续相同碱基，那么释放的质子数目是加倍的，也可以成功判读（因为每一个微珠附有100万的DNA片段，所以结果是显著的）