毕赤酵母（K. phaffii）番茄红素细胞工厂构建：材料方法详解与关键技术细节

        在微生物细胞工厂研究中，“材料选择的合理性” 与 “实验方法的严谨性” 是确保结果可靠、可重复的核心前提。针对毕赤酵母（Komagataella phaffii）CRISPR 基因编辑与番茄红素合成路径优化的研究，其材料与方法设计围绕 “高效载体构建、精准基因改造、稳定发酵检测” 三大目标展开 —— 从菌株与试剂的选型，到质粒构建的细节，再到产物提取分析的参数，每一步均为后续基因编辑效率提升与番茄红素高产奠定基础。本文将系统拆解该研究的材料选择逻辑、实验操作流程及关键技术创新点，为同类毕赤酵母代谢工程研究提供可复用的方法参考。

一、基础材料准备：菌株、培养基与核心试剂的选型逻辑

        实验材料的选择需兼顾 “通用性、稳定性、适配性”，本研究在菌株、培养基与试剂上的选型，均针对毕赤酵母的生物学特性与实验需求设计：

1. 菌株选择：覆盖 “质粒构建 - 底盘改造 - 功能验证” 全流程

• 大肠杆菌 DH5α：作为质粒构建与扩增的宿主，其优势在于遗传背景清晰、感受态转化效率高（可达 10⁸ cfu/μg DNA），且无限制性内切酶系统，可稳定保存重组质粒。实验中用于构建 gRNA 载体、基因表达载体等，培养于 LB 培养基（10g/L 胰蛋白胨 + 5g/L 酵母提取物 + 10g/L NaCl），37℃振荡培养，通过氨苄青霉素（100mg/L）或卡那霉素（50mg/L）筛选阳性克隆。
• 毕赤酵母 CBS7435：选择该菌株作为底盘细胞，核心原因在于其是工业常用的模式菌株 —— 基因组序列明确、无 Crabtree 效应、甲醇诱导下过氧化物酶体增殖能力强，且为 GRAS 菌株，适合后续番茄红素（潜在食品添加剂）的生产。培养于 YPD 培养基（10g/L 酵母提取物 + 20g/L 蛋白胨 + 20g/L 葡萄糖），30℃振荡培养，通过 G418（300mg/L）筛选基因编辑后的阳性菌株。

2. 核心试剂：确保 “扩增 - 克隆 - 转化 - 提取” 效率

        实验中关键试剂的选型均围绕 “提升实验效率与准确性” 展开，核心包括：

• DNA 聚合酶：选用 KodOne DNA 聚合酶（TOYOBO）与 PrimeSTAR Max DNA 聚合酶（Takara）—— 前者高保真、长片段扩增能力强（可扩增长达 20kb 片段），适合启动子、终止子等基因组片段的扩增；后者扩增速度快、特异性高，适合短片段（如基因编码区、gRNA 序列）的扩增，避免非特异性条带干扰。
• 克隆与连接试剂：使用 Hieff Clone™ Plus 一步克隆试剂盒（Yeasen）进行载体构建，无需酶切后纯化，可直接将 PCR 产物与线性化载体连接，连接效率较传统 T4 连接提升 5-10 倍；限制性内切酶与 T4 DNA 连接酶（Thermo Fisher）则用于需精准酶切的载体改造（如 gRNA scaffold 插入）。
• 酵母操作试剂：毕赤酵母感受态制备与电转化参考 Invitrogen 毕赤酵母表达试剂盒，确保感受态转化效率达 10⁴ cfu/μg DNA 以上；酵母质粒提取使用 HiPure 酵母质粒小提试剂盒（Magen），可高效去除酵母细胞壁多糖等杂质，获得高质量质粒用于测序验证。

二、核心实验流程：从质粒构建到菌株改造的关键步骤

        本研究的核心是通过 CRISPR/Cas9 技术实现毕赤酵母的多基因编辑与番茄红素合成路径构建，实验流程可分为 “质粒构建”“菌株转化与筛选”“发酵与产物检测” 三大模块，每一步均有明确的技术创新与操作细节：

1. 质粒构建：聚焦 “CRISPR 工具优化” 与 “番茄红素路径基因载体”

        质粒构建是基因编辑的基础，本研究设计了两类核心质粒 ——CRISPR 编辑工具质粒（gRNA 载体）与番茄红素合成路径基因表达载体，关键细节如下：

（1）CRISPR gRNA 载体改造：双荧光标记 + 高效 gRNA 加工

        为解决传统 gRNA 载体筛选难、标记回收繁琐的问题，研究对 gRNA 载体进行了三项关键改造，构建出核心载体 pGS327：

• 基础骨架与 Cas9 表达：以 pUC19 为基础骨架，整合酿酒酵母 Cas9（SpCas9，GenBank: UFQ04583.1）表达盒，参考已报道载体 pPpT4_pHTX1-PARS1-HsCas9 优化启动子，确保 Cas9 在毕赤酵母中高效表达；
• gRNA 加工元件优化：摒弃传统的锤头核酶（Hammerhead ribozyme），从毕赤酵母基因组克隆 tRNAGly 序列 ——tRNAGly 可通过自身的加工机制高效切割 gRNA 转录本，使 gRNA 正确折叠，提升 CRISPR 编辑效率（参考 Dalvie 等 2020 年研究，tRNA 介导的 gRNA 加工可使敲除效率提升 30% 以上）；同时引入 HDV 核酶确保 gRNA 3' 端精准切割；
• 双荧光标记添加：在载体中插入 GFP（绿色荧光蛋白，GenBank: OM858837.1）与 RFP（红色荧光蛋白，PDB: 7ARQ_AA）表达盒 ——GFP 用于阳性转化子筛选（仅含载体的酵母发绿色荧光），RFP 用于标记回收可视化（标记基因切除后 RFP 荧光消失），大幅简化筛选与验证步骤。

        此外，载体中还整合了毕赤酵母自主复制序列 PARS1（GenBank: M11199.1），确保 gRNA 质粒在酵母细胞中稳定复制，无需整合到基因组即可发挥作用，降低对底盘菌株基因组的干扰。

（2）番茄红素合成路径基因载体：多基因分载与启动子匹配

        番茄红素合成需 11 个关键酶基因协同表达，研究将这些基因分别克隆到不同载体，每个基因搭配适配的组成型启动子，确保表达强度平衡：

• 基因来源：核心基因分为两类 ——①番茄红素合成直接相关基因：crtE（法夫酵母 Phaffia rhodozyma，GenBank: DQ016502.1）、crtI（同法夫酵母，GenBank: AY177424.1）、crtYB（同法夫酵母，GenBank: AY177204.1，通过定点突变获得 crtYBW61R 突变体，提升酶活性）；②甲羟戊酸（MVA）途径基因（为番茄红素提供前体 IPP）：tHMG1（酿酒酵母 S. cerevisiae，GenBank: NM_001182434.1）、ERG10、ERG8、ERG12、mMVD1、ERG20、mERG13、IDI1（均来自酿酒酵母，GenBank 号详见原文）；
• 启动子选择：根据基因功能与表达需求，搭配不同强度的组成型启动子 —— 如 crtI 用 PADH2（中强度）、crtE 用 PGAP（高强度）、crtYB 用 PFBP1（中高强度），MVA 途径基因 tHMG1 用 PFBA1（高强度），确保前体供应与番茄红素合成速率匹配，避免中间产物积累。

2. 毕赤酵母转化与筛选：精准控制 DNA 用量与筛选条件

        基因编辑的效率与转化操作细节密切相关，本研究在转化与筛选中严格控制关键参数：

• 感受态与电转：参考 Invitrogen 试剂盒方法制备毕赤酵母感受态，电转条件为 1.5kV、25μF、200Ω，确保 DNA 高效进入细胞；
• DNA 用量控制：CRISPR 介导的基因组整合实验中，gRNA 质粒与各基因表达盒 DNA 用量均为 2μg，上下游同源臂用量为 1μg（同源臂长度约 1000bp，确保同源重组效率）；所有 DNA 片段（除同源臂外）长度控制在 1800-3600bp，避免片段过长导致转化效率下降；
• 阳性筛选：转化后酵母涂布于含 300mg/L G418 的 YPD 平板，30℃培养 3-5 天 ——G418 抗性基因随编辑片段整合到基因组，仅成功编辑的菌株可存活；同时通过荧光显微镜观察 GFP/RFP 荧光，进一步确认阳性克隆，减少假阳性。

3. 摇瓶发酵与产物分析：标准化流程确保结果可重复

        番茄红素的产量检测需严格控制发酵条件与提取分析步骤，避免操作差异导致结果偏差：

（1）摇瓶发酵：标准化种子培养与发酵参数

• 种子培养：从 YPD 平板挑取单克隆，接种到 5mL YPD 试管，30℃、220rpm 振荡培养过夜；取 500μL 过夜培养物转接至 20mL YPD，继续培养 12h，获得对数生长期种子液（OD600≈2.0）；
• 发酵培养：将种子液按初始 OD600=0.2 转接至 250mL 摇瓶（含 50mL YPD），30℃、220rpm 振荡发酵 7 天 —— 摇瓶转速控制确保溶氧量充足（避免厌氧导致副产物积累），发酵周期覆盖酵母生长与产物合成的完整阶段；每天取样一次，监测细胞密度与番茄红素产量变化。

（2）番茄红素提取与 HPLC 分析：高效提取与精准定量

• 细胞破碎与提取：取 500μL 发酵液，离心收集细胞（8000rpm，5min），用去离子水洗涤 2 次；加入 500μL 3M HCl 重悬，沸水浴 4min（裂解酵母细胞壁）后冰浴 3min（防止番茄红素降解）；再次离心去除上清，沉淀用去离子水洗涤 2 次，加入 500μL 丙酮涡旋混匀，室温避光提取 30min（番茄红素易溶于丙酮，且避光避免光氧化）；
• HPLC 定量分析：参考 Ma 等 2019 年方法，使用 Agilent sb-aq 色谱柱，流动相 A 为 90% 乙腈水溶液（v/v），流动相 B 为甲醇：异丙醇 = 3:2（v/v），梯度洗脱程序为：0-15min（A 从 100% 降至 10%，B 从 0 升至 90%）、15-30min（A 保持 10%，B 保持 90%）、30-35min（A 从 10% 升至 100%，B 从 90% 降至 0%），流速 1mL/min，检测波长 474nm（番茄红素的特征吸收峰）—— 该方法可有效分离番茄红素与其他类胡萝卜素杂质，定量准确率达 95% 以上。

三、方法设计的核心优势：为毕赤酵母代谢工程提供可复用模板

        本研究的材料与方法设计，不仅服务于番茄红素合成这一具体目标，更针对毕赤酵母基因编辑的共性痛点（如载体筛选难、编辑效率低、产物检测繁琐）提供解决方案，其核心优势体现在三方面：

1. CRISPR 工具通用化：改造的 gRNA 载体 pGS327 含双荧光标记与 tRNAGly 介导的 gRNA 加工元件，可直接用于其他基因的编辑（如敲除冗余代谢基因、整合其他产物合成路径），无需重复构建载体；
2. 多基因表达平衡化：根据基因功能匹配不同强度启动子，为其他复杂代谢路径（如黄酮、萜类合成）的多基因调控提供参考；
3. 检测流程标准化：番茄红素的提取与 HPLC 分析方法可推广至其他脂溶性天然产物（如 β- 胡萝卜素、虾青素）的检测，减少方法开发周期。

        泰克生物聚焦毕赤酵母代谢工程研究，提供 CRISPR 编辑专用 gRNA 载体（含双荧光标记）、番茄红素合成路径基因表达试剂盒及酵母发酵产物提取辅助试剂，助力科研人员标准化开展菌株改造与产物检测，加速微生物细胞工厂构建进程。