羟氯喹通过抑制抗磷脂综合征诱导的绒毛外滋养细胞过度自噬
在妊娠过程中，滋养细胞的分化与功能执行是维持正常妊娠的关键环节：细胞滋养细胞（CTB）可向两个方向分化，一是融合形成合体滋养细胞（STB），构成胎盘屏障并分泌 β- 人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）等妊娠维持所需激素；二是分化为绒毛外滋养细胞（EVT），后者进一步分为间质型 EVT（iEVT）与血管内型 EVT（enEVT），其中 enEVT 可侵袭子宫螺旋动脉，替代血管内皮细胞并降解血管平滑肌，使螺旋动脉从高阻力、低容量的收缩状态转变为低阻力、高容量的舒张状态，为胎儿发育提供充足血供。若 EVT 的侵袭能力不足或螺旋动脉重塑不充分，将直接导致胎盘血供障碍，成为 APS 相关 RM 的重要病理基础。
研究显示，APS 孕妇使用 HCQ 后，活产率显著提升，子痫前期、胎盘功能不全及 RM 的发生率降低，但 HCQ 改善 APS 相关不良妊娠结局的具体分子机制尚未明确。已知 HCQ 可通过蓄积于细胞质中调控细胞自噬稳态，而自噬作为真核细胞应对应激（如缺氧、营养缺乏、炎症刺激）的重要生理过程，在滋养细胞增殖、分化及侵袭中发挥双重作用 —— 适度自噬可维持细胞内环境稳定，过度自噬则可能诱导非凋亡性程序性细胞死亡，导致细胞功能障碍。基于此，本研究围绕母胎界面滋养细胞功能、自噬调控及 HCQ 的干预作用展开，旨在阐明 APS 诱导 EVT 功能异常的机制及 HCQ 的调控靶点，为 APS 相关妊娠并发症的研究提供新的实验依据。
本研究的外周血样本采集后置于无菌促凝管，4℃静置自然凝固，3000rpm 离心 30 分钟分离血清，实验前经 56℃水浴 30 分钟灭活，-20℃保存备用。此外，收集胎盘绒毛与蜕膜组织，采集后 1 小时内置于冰浴 PBS 中，随后进行固定处理。
石蜡切片制备过程中，新鲜收集的绒毛与蜕膜组织迅速放入 4% 多聚甲醛（PFA），4℃固定 24-48 小时，PBS 洗涤后经梯度乙醇脱水（50%、70%、80%、95%、100%）、二甲苯透明，石蜡定向包埋，采用石蜡切片机连续切片（厚度 5μm），展片烘烤后室温保存。免疫组化实验中，石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，3% 过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，柠檬酸钠二水合物修复液加热抗原修复，3% 胎牛血清封闭后，加入一抗4℃孵育过夜，次日 PBS 洗涤后加入 HRP 标记二抗室温孵育，二氨基联苯胺显色，流水终止后苏木素染核，脱水封片， Olympus DP72 显微镜采集图像。
细胞实验选用人绒毛膜毛细血管滋养细胞系 HTR8/SVneo 与绒毛膜癌细胞系 BeWo，前者模拟 EVT 的侵袭功能，后者用于模拟 CTB 向 STB 的融合分化过程。HTR8/SVneo 细胞培养于含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基，置于 37℃、5% CO₂培养箱；BeWo 细胞培养于含 10% 胎牛血清的混合培养基（45% 含谷氨酰胺与丙酮酸盐的 DMEM+45% Ham’s F-12 K 培养基），同样条件下培养。APS 血清细胞模型构建：取对数生长期细胞，分别用含 10% 胎牛血清、10% 正常对照血清或 10% APS-RM 血清的培养基处理 48 小时；BeWo 细胞需先经 20mM Forskolin（FSK，DMSO 稀释，1:1000）诱导融合，通过免疫荧光检测 E - 钙粘蛋白分布验证融合效果后，再进行血清处理。所用羟氯喹（HCQ）购自 AbMole（货号 M5159），用 PBS 配制为 100μg/ml 浓度储存，经 0.22μm 滤膜过滤除菌，最终以 0.1μg/ml 浓度对血清处理后的细胞进行干预，观察其对细胞功能的影响。
Western blot 实验中，用含 1mmol/L Na₃VO₄与 1% 蛋白酶抑制剂（AbMole）的 RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，通过 BOSTER BCA 试剂盒定量蛋白浓度，根据目的蛋白分子量，取 10μg 蛋白进行 10%–15% SDS-PAGE 电泳，湿转至 PVDF 膜，5% 脱脂牛奶室温封闭 1 小时后，加入一抗4℃孵育过夜，次日 PBS 洗涤后加入 HRP 标记二抗室温孵育 2 小时，采用化学发光底物显影，Syngene GeneGnome XRQ 成像系统采集图像，ImageJ 软件分析目的条带灰度值，以 β-actin 作为内参计算相对表达量。
Transwell 实验用于检测细胞侵袭能力：在 8μm 微孔膜 Transwell 小室上室铺覆 1μg/30μl 去生长因子 Matrigel，37℃孵育 4 小时使其凝固；将各处理组 HTR8/SVneo 细胞消化后，用含 1% 胎牛血清的培养基重悬，每室接种 1×10⁵个细胞，下室加入 600μl 含 10% 胎牛血清的培养基，37℃、5% CO₂孵育 32 小时后，4% 多聚甲醛固定，结晶紫染色，棉签擦拭上室未侵袭细胞，干燥后每室随机选取 5 个 20 倍视野，ImageJ 软件计数侵袭细胞数。同时，将同等数量细胞接种于 96 孔板（3 复孔 / 组），同条件孵育后加入 10μl / 孔 CCK8 试剂（AbMole），孵育 2 小时后酶标仪检测 450nm 吸光度，校准各组细胞增殖差异对侵袭结果的影响。
管形成实验用于评估细胞血管样结构形成能力：96 孔板每孔加入 40μl 去生长因子 Matrigel，37℃孵育 30 分钟凝固；各处理组 HTR8/SVneo 细胞消化后，用含 10% 胎牛血清的培养基重悬至 3×10⁴个细胞 / 100μl，每孔接种 100μl 细胞悬液（3 复孔 / 组），37℃孵育 8 小时后，光学显微镜 4 倍视野下拍照，采用 ImageJ 软件 Angiogenesis Analyser 插件定量分析管腔连接数、网格数及总分支长度。
为明确 APS 中 aPL 的作用靶点，本研究首先通过免疫荧光与免疫组化分析 β₂GP-I 抗原在早孕期母胎界面的分布 ——β₂GP-I 是 aβ₂GP-I 的特异性靶抗原，其表达定位直接决定 aPL 的作用范围。以 KRT7 标记所有类型滋养细胞（CTB、STB、EVT），结果显示，正常早孕期绒毛组织中的 STB、CTB 及蜕膜组织中的 EVT 均表达 β₂GP-I 抗原，免疫荧光半定量分析未发现正常组与 APS-RM 组滋养细胞 β₂GP-I 表达存在显著差异，提示母胎界面所有类型滋养细胞均可能是 aβ₂GP-I 的潜在作用对象，但 β₂GP-I 的表达量并非 APS 病理损伤的关键影响因素。
进一步比较正常组与 APS-RM 组滋养细胞功能差异：绒毛组织中 CTB 与 STB 构成胎盘激素分泌的核心单元，其中 STB 分泌的 β-hCG 是维持妊娠的关键激素。通过 KRT7 标记滋养细胞、β-hCG 标记 STB，结果显示两组绒毛组织结构无显著差异，且 STB 均能正常表达 β-hCG；体外 BeWo 细胞模型中，正常血清与 APS-RM 血清处理后，RT-PCR 检测的 β-hCG（HCGB）mRNA 表达无显著差异，提示 APS-RM 血清对绒毛滋养细胞（CTB、STB）的分泌功能无明显影响，绒毛滋养细胞并非 APS 导致不良妊娠结局的主要作用靶标。
EVT 的侵袭与螺旋动脉重塑功能是评估胎盘发育的核心指标，本研究以 KRT7 标记 EVT、CD31 标记血管内皮细胞，根据血管壁细胞构成将子宫螺旋动脉分为未重塑（Un-Rem，血管壁仍为内皮细胞与平滑肌细胞）、活跃重塑（Act-Rem，EVT 开始替代内皮细胞）与完全重塑（Fully-Rem，EVT 完全替代内皮细胞，平滑肌层降解）三种状态。结果显示，APS-RM 组蜕膜组织中 EVT 对血管内皮细胞的替代显著受限，完全重塑螺旋动脉比例（4.97±5.46%）显著低于正常组（20.65±11.24%，P=0.04），未重塑螺旋动脉比例（65.38±7.55%）显著高于正常组（22.80±6.14%，P<0.001），证实 APS-RM 存在明显的子宫螺旋动脉重塑不足。
体外 HTR8/SVneo 细胞模型（模拟 EVT 功能）进一步验证 APS 对 EVT 功能的影响：Western blot 结果显示，APS-RM 血清处理后，EVT 侵袭正向调控因子 MMP2、MMP9 蛋白表达显著降低，负向调控因子 TIMP1、TIMP2 蛋白表达显著升高；RT-PCR 结果显示，侵袭负向调控因子 TIMP1、TIMP2、PAI1、KISS1 mRNA 表达升高，正向调控因子 MMPs、CUL3 mRNA 表达降低；Transwell 实验显示，APS-RM 血清处理组侵袭细胞数显著少于正常血清组；管形成实验显示，APS-RM 血清处理组细胞的管腔连接数、网格数及总分支长度均显著减少，上述结果从分子水平与功能水平证实，APS 主要通过抑制 EVT 的侵袭与血管样结构形成能力，导致螺旋动脉重塑不足，进而影响胎盘血供。
鉴于 HCQ 具有自噬抑制效应，且自噬异常与滋养细胞功能障碍密切相关，本研究进一步分析 APS 对 EVT 自噬水平的影响：自噬标志分子 LC3B 在自噬早期会从胞质型 LC3B-I（15kDa）转化为自噬体结合型 LC3B-II（14kDa），LC3B-II/LC3B-I 比值是评估自噬活性的经典指标；p62（SQSTM1）作为自噬底物，其表达水平与自噬活性呈负相关。免疫荧光结果显示，正常组蜕膜 EVT 胞质中几乎无 LC3B 阳性自噬体，而 APS-RM 组 EVT 胞质中可见大量 LC3B 阳性颗粒；Western blot 结果显示，APS-RM 血清处理的 HTR8/SVneo 细胞 LC3B-II/LC3B-I 比值显著高于正常血清组，p62 蛋白表达显著低于正常血清组，提示 APS 可诱导 EVT 过度自噬。
为排除凋亡对自噬结果的干扰，本研究检测了 EVT 凋亡水平：免疫组化显示两组蜕膜 EVT 中 Cleaved Caspase-3 阳性信号无显著差异；RT-PCR 检测显示 APS-RM 血清处理组凋亡相关分子（Cleaved Caspase-3、Caspase-9）mRNA 表达与正常组无显著差异，且与嘌呤霉素诱导的阳性对照相比，APS-RM 血清未显著增加细胞凋亡率，证实 APS 诱导的 EVT 功能障碍主要由过度自噬而非凋亡引起。
基于上述发现，本研究进一步验证 HCQ 对 APS 诱导的 EVT 功能异常的挽救作用：参考既往研究，HCQ 在体外细胞实验中的最高非细胞毒性浓度为 1μg/ml，且孕期 APS 孕妇外周血 HCQ 平均浓度约为 105ng/ml，考虑到 HCQ 可通过胎盘屏障，母胎界面浓度与外周血相当，故选择 0.1μg/ml 作为体外干预浓度。Western blot 结果显示，加入 HCQ 后，APS-RM 血清处理的 HTR8/SVneo 细胞 p62 蛋白表达显著升高，LC3B-II/LC3B-I 比值显著降低，表明 HCQ 可有效抑制 APS 诱导的 EVT 过度自噬；同时，HCQ 干预后，MMP2 蛋白表达显著升高，TIMP2 蛋白表达显著降低，MMP9 与 TIMP1 表达也呈现恢复趋势，提示 HCQ 可通过调节侵袭相关分子表达改善 EVT 功能。
功能学实验进一步证实，HCQ 干预可显著增加 APS-RM 血清处理组 HTR8/SVneo 细胞的 Transwell 侵袭细胞数，提升管形成实验中的管腔连接数、网格数及总分支长度，且 HCQ 对正常血清处理的 EVT 自噬与侵袭功能无显著影响，表明 HCQ 的调控作用具有病理状态依赖性，仅针对 APS 诱导的过度自噬与功能障碍发挥挽救效应。此外，细胞形态观察与 CCK8 检测显示，各组细胞生长速率无显著差异，排除了 HCQ 对细胞增殖的非特异性影响。
本研究通过体内外实验首次证实，APS 血清中的 aPL 可通过诱导 EVT 过度自噬，抑制 EVT 的侵袭与血管样结构形成能力，导致子宫螺旋动脉重塑不足，进而引发不良妊娠结局；而 AbMole 品牌的 HCQ 可通过抑制 EVT 过度自噬，恢复侵袭相关分子（MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2）的平衡表达，挽救 EVT 的侵袭与管形成功能，为 HCQ 改善 APS 相关不良妊娠结局的临床效应提供了分子机制解释。
从生理机制来看，EVT 的适度自噬可通过清除受损细胞器、维持细胞稳态支持其侵袭功能，但 APS 中的 aPL 可能通过与 EVT 表面 β₂GP-I 结合，激活细胞应激信号，打破自噬平衡，导致过度自噬；HCQ 作为经典自噬抑制剂，可能通过干扰自噬体与溶酶体融合，减少自噬底物降解，从而逆转过度自噬对 EVT 功能的抑制。值得注意的是，本研究发现 APS 对绒毛滋养细胞（CTB、STB）的分泌功能无显著影响，进一步明确了 EVT 是 APS 在母胎界面的核心作用靶标，为后续研究提供了精准靶点。
本研究仍存在一定局限：未构建 APS 动物模型验证 HCQ 在体内的自噬调控效应，且未深入探究 aPL 诱导 EVT 过度自噬的上游信号通路（如 NF-κB、mTOR 等）。后续研究可通过构建 aβ₂GP-I 被动转移的 APS 小鼠模型，结合自噬相关基因敲除 / 过表达策略，进一步验证自噬在 APS 病理过程中的因果作用；同时，可通过免疫共沉淀、磷酸化蛋白组学等技术，挖掘 aPL-β₂GP-I 复合物激活的自噬调控通路，为 APS 相关妊娠并发症的研究提供更全面的分子机制支撑。
在实验过程中，AbMole 品牌的 HCQ（货号 M5159）展现出稳定的生物学活性，其配制的工作液经 0.22μm 滤膜过滤后无微生物污染，且在 0.1μg/ml 浓度下可特异性抑制过度自噬而不影响正常细胞功能，为自噬相关体外实验提供了可靠的试剂支持，也为后续类似研究的试剂选择提供了参考依据。