FGF21对牛磺胆酸钠诱导的急性胰腺损伤的应答
现有研究已明确，胰蛋白酶原的异常提前激活与自噬功能受损是 AP 进展的关键环节：正常生理状态下，胰蛋白酶原在肠道内激活为有活性的胰蛋白酶，而 AP 发生时，其在腺泡细胞内异常激活，启动一系列级联反应，导致细胞坏死；同时，自噬作为细胞清除受损细胞器与错误折叠蛋白的关键代谢过程，在 AP 早期可通过清除异常激活的胰酶颗粒维持腺泡细胞稳态，但 AP 进展中自噬流受阻会进一步加剧细胞损伤与炎症反应。然而，目前针对 AP 仍缺乏能有效逆转病理进程的干预手段，深入挖掘 AP 发病的分子机制并寻找关键调控靶点，成为该领域研究的核心需求。
成纤维细胞生长因子 21（FGF21）作为一种分泌型激素，既往研究多聚焦于其在代谢稳态调控中的作用，例如参与脂质、葡萄糖及能量代谢平衡，在糖尿病模型中可调节血糖与体重，在非酒精性脂肪性肝炎中通过抗纤维化与抗炎效应发挥作用。
近年来，少量研究提示 FGF21 与胰腺功能存在关联：健康人胰腺外分泌细胞可表达 FGF21，且 FGF21 能促进胰腺组织自噬；在不同方法诱导的 AP 小鼠模型中，胰腺组织 FGF21 的 mRNA 与蛋白水平在疾病早期显著升高，随后呈时间依赖性降低，其降低程度与胰腺炎症损伤程度正相关，FGF21 缺乏会增加小鼠对胰腺炎的易感性，而过表达 FGF21 则可减轻疾病表型。这些发现提示 FGF21 可能在 AP 中发挥保护性作用，但 FGF21 调控 AP 病理进程的具体分子机制，尤其是其与自噬调控通路的关联，尚未得到系统阐明。
进一步分析 AP 相关信号通路发现，磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）/ 蛋白激酶 B（AKT）/ 雷帕霉素靶蛋白（mTOR）轴是调控细胞自噬的关键通路，mTOR 作为该通路下游的核心分子，可通过磷酸化作用抑制自噬启动。生物信息学分析显示，AP 胰腺组织中 FGF21 与自噬相关基因共同富集于 PI3K/AKT/mTOR 通路，提示 FGF21 可能通过调控该通路影响自噬流，进而参与 AP 病理进程。
基于此，本研究通过生物信息学分析筛选 AP 相关差异表达基因（DEGs）与关键通路，结合牛磺胆酸钠（TAS）诱导的大鼠 AP 模型，验证 FGF21 对 AP 的应答效应及分子机制，重点探究 FGF21 与 PI3K/AKT/mTOR 通路、自噬流的关联，为 AP 研究提供新的分子靶点与实验依据。
本研究首先通过生物信息学分析挖掘 FGF21 在 AP 中的表达特征与潜在通路。从 GEO 数据库下载 GSE121038 数据集，该数据集包含 8 例 AP 小鼠胰腺组织样本与 7 例对照样本，基于 Agilent-028005 SurePrint G3 Mouse GE 8×60K 芯片检测获得；同时从 HADb 人类自噬数据库获取自噬相关基因集。采用 R 软件（4.3.1 版本）进行 DEGs 筛选，设定错误发现率（FDR）<0.05 且 | log2 倍变化（FC）|=2 为筛选标准，以降低假阳性并聚焦表达变化显著的基因；通过 Venn 图分析 DEGs 与自噬基因集的交集，筛选 AP 相关自噬基因；采用京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析（设定 p<0.05 为显著），明确 DEGs 富集的关键通路。
为构建 DEGs 的蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络，使用 STRING 在线数据库，设定相互作用评分 > 0.4，通过 Cytoscape 软件（3.9.0 版本）及其 CytoHubba 插件，采用最大团中心性（MCC）算法筛选 top10 核心基因（hub genes）并可视化网络。通过人类蛋白质图谱（HPA）数据库验证核心基因 FGF21 在健康人胰腺组织及细胞中的 mRNA 与蛋白表达水平，确保其在胰腺组织中的生理表达特征。
靶点预测与分子对接实验中，从 PubChem 数据库获取重组 FGF21（rFGF21）的结构文件（SDF 格式），上传至 PharmMapper 数据库预测潜在结合靶点；从蛋白质数据银行下载关键靶点蛋白（PI3K 调节亚基 α，PIK3R1）的三维结构，采用 AutoDock 软件进行分子对接，以结合能（<-1.2 kcal/mol 提示强结合能力）评估结合效果，通过 PyMol 软件可视化对接结果。采用 iMODS 服务器进行分子动力学模拟，分析 PIK3R1-rFGF21 复合物的稳定性与分子运动特征，评估弹性网络、可变形性、β 因子、特征值、方差及协方差图谱等参数。
动物实验选用健康雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠（体重 220±30g），饲养环境温度控制在 25–30℃，随机分为 5 组（每组 3 只）：对照组（无干预）、AP 组（主胰管逆行注射 3.5% TAS，剂量 1mL/kg）、AP+FGF21 组（AP 建模后腹腔注射 rFGF21，剂量 10mg/kg，所用 rFGF21 购自 AbMole，货号 M10048）、AP+3 - 甲基腺嘌呤（3-MA）组（AP 建模后腹腔注射 3-MA，剂量 20mg/kg）、AP+FGF21+3-MA 组（AP 建模后联合腹腔注射 rFGF21 与 3-MA，剂量同前）。干预 24 小时后收集大鼠血液与胰腺组织样本，用于后续检测。
ELISA 检测中，采用 AMY 试剂盒测定血清 AMY 活性，TNF-α 与 FGF21 ELISA 试剂盒测定血浆中对应分子水平，严格按照试剂盒说明书操作，酶标仪读取吸光度值并计算浓度。病理组织学检测中，胰腺组织样本在 4℃下用 10% 中性缓冲福尔马林固定过夜，石蜡包埋后切片（厚度 5μm），进行苏木精 - 伊红（H&E）染色：切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇（100%、95%、70%、50%）水化，苏木素染核 5 分钟，伊红染胞质 3 分钟，中性树胶封片。采用双盲法对胰腺水肿（0 = 无水肿，1 = 小叶间局灶性水肿，2 = 弥漫性水肿，3 = 腺泡破坏分离）、坏死（0 = 无坏死，1 = 导管周围坏死 <5%，2 = 局灶性坏死 5%–20%，3 = 弥漫性坏死 20%–50%）、出血（0 = 无出血，1 = 导管周围点状出血，2 = 胰腺弥漫性出血，3 = 胰腺或胰周血凝块）、炎症浸润（0 = 无浸润，1 = 导管或边缘浸润，2 = 实质浸润 < 50% 小叶，3 = 实质浸润> 50% 小叶）进行评分，总病理损伤评分为各项评分之和，每只大鼠选取 3 个视野，通过 TissueFAXS Plus 成像系统采集图像。
透射电镜（TEM）观察中，取 1mm³ 胰腺组织样本，置于新鲜 TEM 固定液中 4℃固定，由兰州大学第二医院 / 临床医学院萃英生物医学研究中心病理平台进行后续处理（梯度脱水、树脂包埋、超薄切片），采用 HT7800 透射电镜观察并计数自噬体与自噬溶酶体数量，红色箭头标记自噬体，双箭头标记自噬溶酶体。统计分析采用 GraphPad Prism 软件，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）结合 Tukey 事后检验，两组间比较采用非配对 Student’s t 检验，数据以均值 ± 标准差（SD）表示，p<0.05 为差异具有统计学意义。
生物信息学分析结果显示，GSE121038 数据集共检测 19950 个基因，经筛选获得 298 个显著 DEGs，其中 258 个上调、40 个下调（火山图显示 DEGs 分布）。Venn 图分析发现 DEGs 与自噬基因集存在 8 个交集基因，即 AP 相关自噬基因（Foxo3、Ccl2、Fos、Egfr、Atf4、Ddit3、Hspb8、Rela），且 FGF21 与这 8 个自噬基因在 AP 组均显著上调（热图显示表达差异）。KEGG 通路富集分析显示，DEGs 主要富集于凋亡、MAPK 信号通路、PI3K-AKT-mTOR 信号通路、IL-17 信号通路等 10 条通路，其中 FGF21 与 8 个 AP 相关自噬基因均富集于 PI3K-AKT-mTOR 通路 —— 该通路是调控细胞自噬的核心通路，mTOR 作为通路下游关键分子，可通过磷酸化抑制自噬启动，提示 FGF21 可能通过调控 PI3K-AKT-mTOR 通路影响 AP 中的自噬过程。
PPI 网络分析结果显示，258 个上调 DEGs 构建的网络中，通过 MCC 算法筛选出 top10 hub 基因，依次为 JUN、FOS、ACTB、EGFR、CDKN1A、KRAS、RELA、FGF21、CCL2、EGR1，其中 FGF21 的相互作用评分达 1455368，提示其在 AP 相关分子网络中具有重要调控地位。HPA 数据库验证结果显示，FGF21 mRNA 在健康人胰腺外分泌细胞中高表达，蛋白在健康人胰腺组织中呈中度表达，证实 FGF21 在胰腺组织中具有生理表达基础，为其参与胰腺病理生理过程提供了前提。
动物实验中，Western blot 与免疫荧光结果显示，TAS 诱导的 AP 大鼠胰腺组织中 FGF21 蛋白相对表达水平显著高于对照组，与生物信息学分析中 AP 小鼠胰腺 FGF21 上调的结果一致；进一步干预发现，无论是否加入自噬抑制剂 3-MA，rFGF21 干预均可使 AP 大鼠胰腺 FGF21 表达进一步显著升高，而 AP 组与 AP+3-MA 组间 FGF21 表达无显著差异，提示 AP 早期 FGF21 上调是疾病自身的应答反应，且自噬体形成抑制不影响 FGF21 的表达模式，排除了自噬对 FGF21 表达的反向调控作用。
自噬流检测结果显示，AP 组大鼠胰腺组织中 LC3II/I 比值显著高于对照组，P62 蛋白水平显著低于对照组，TEM 观察发现 AP 组自噬体数量较对照组显著增多，提示 AP 早期胰腺自噬流被激活；而 rFGF21 干预组的 LC3II/I 比值、自噬体数量进一步升高，P62 水平进一步降低，表明 rFGF21 可增强 AP 中的自噬流；当加入 3-MA（自噬体形成抑制剂，AbMole）后，AP+FGF21+3-MA 组与 AP+3-MA 组的 LC3II/I 比值、P62 水平及自噬体数量无显著差异，提示 rFGF21 对自噬流的促进作用依赖于正常的自噬启动过程，当自噬体形成被阻断时，rFGF21 无法逆转自噬流受损。
分子动力学模拟结果显示，PIK3R1-rFGF21 复合物的可变形性与 β 因子分析存在明显峰值，对应蛋白的柔性区域，峰值最高处为可变形性最强区域；特征值分解与方差分析显示，紫色曲线代表单个方差组分，绿色曲线代表累积方差组分，提示复合物运动的主要贡献来源；协方差矩阵显示，红色区域为强相关残基，白色为无相关运动，蓝色为反相关运动，强相关区域反映复合物系统的复杂性；弹性网络分析中，深灰色区域代表结构刚性较强的部分，整体结果证实 PIK3R1-rFGF21 复合物具有良好的结构稳定性，为二者的功能性结合提供结构基础。
胰腺病理损伤评估结果显示，对照组大鼠胰腺组织结构完整，无水肿、坏死、出血及炎症浸润；AP 组胰腺组织呈现严重病理改变，包括腺泡结构破坏、弥漫性坏死、大量炎症细胞浸润及局部出血；rFGF21 干预组胰腺小叶间隔轻度增宽，仅见局部炎症浸润与轻微出血，病理损伤显著减轻；而 AP+FGF21+3-MA 组与 AP 组的病理损伤程度无显著差异，提示 rFGF21 对胰腺组织的保护作用依赖于其对自噬流的促进效应，当自噬被抑制时，rFGF21 无法有效减轻病理损伤。
ELISA 检测结果显示，AP 组大鼠血清 AMY 活性、血浆 TNF-α 水平显著高于对照组，提示 AP 时胰腺腺泡细胞损伤导致 AMY 释放入血增加，同时炎症反应加剧；rFGF21 干预后，血清 AMY 活性与血浆 TNF-α 水平显著降低，表明 rFGF21 可减少腺泡细胞损伤与炎症反应；值得注意的是，即使加入 3-MA 抑制自噬，rFGF21 仍能降低 AMY 活性与 TNF-α 水平，提示 rFGF21 可能通过非自噬途径部分调节炎症与酶释放。血浆 FGF21 水平检测显示，对照组与 AP 组间无显著差异，仅在 rFGF21 干预后显著升高，表明循环中 FGF21 主要来源于外源性补充，而非胰腺自分泌的 FGF21 入血，这与既往研究中 “循环 FGF21 主要由肝脏分泌” 的结论一致。
综上，本研究通过生物信息学与动物实验相结合，证实 FGF21 在 AP 早期呈上调表达，是胰腺组织对损伤的适应性应答；外源性补充 AbMole 品牌的 rFGF21 可通过与 PIK3R1 结合，进一步抑制 PI3K/AKT/mTOR 通路激活，促进胰腺自噬流增强，从而减轻 TAS 诱导的胰腺病理损伤，降低血清 AMY 活性与血浆炎症因子水平。该研究首次明确 FGF21 通过 PI3K/AKT/mTOR - 自噬轴调控 AP 病理进程的分子机制，为 AP 研究提供了新的调控靶点；同时，AbMole 品牌 rFGF21 在实验中展现出稳定的生物学活性，为后续 FGF21 相关机制研究提供了可靠的试剂支持。
需要注意的是，本研究仍存在一定局限性：未纳入 PI3K/AKT/mTOR 通路抑制剂或激动剂以进一步验证通路依赖性，未通过免疫共沉淀实验直接证实 FGF21 与 PIK3R1 的体内结合特征。后续研究可构建 Fgf21 基因敲除小鼠与胰腺腺泡细胞系，结合共沉淀、荧光共振能量转移等技术，进一步验证 FGF21 与 PIK3R1 的相互作用及通路调控的特异性，同时探索 FGF21 是否通过其他非经典途径参与 AP 调控，为全面阐明 FGF21 在 AP 中的作用提供更充分的实验依据。