脂质体转染、物理转染（电穿孔）与病毒转染：原理及操作步骤详解

转染技术是分子生物学和细胞生物学实验中的核心技术之一，其通过将外源核酸（DNA、RNA 等）导入细胞内，实现基因表达调控、功能研究或细胞模型构建。本文将详细解析三种常用转染技术 —— 化学转染（以脂质体法为例）、物理转染（以电穿孔为例）及病毒转染（以慢病毒载体为例）的核心原理与实操步骤，为实验人员提供参考。

一、化学转染：脂质体法原理与操作步骤

脂质体转染是目前实验室最常用的化学转染方法之一，其核心优势在于操作简便、适用性广，对多数贴壁细胞和部分悬浮细胞均有较好效果。

1. 核心原理

脂质体转染的关键载体为阳离子脂质体，其结构中含带正电的头部基团，可与带负电的外源核酸（如质粒 DNA）通过静电相互作用自发形成核酸 - 脂质体复合物。由于细胞膜表面通常带负电，复合物可通过电荷吸引吸附于细胞膜表面，随后通过细胞的内吞作用进入细胞，释放核酸实现表达。

2. 实操步骤（以 293T 细胞 - Lip 脂质体转染试剂为例）

（1）细胞培养准备

转染前 1 天（20-24 小时），将对数生长期的 293T 细胞以约 0.4×10⁶个 / 孔的密度接种至六孔板，确保转染时细胞汇合度达到 70%-90%（汇合度过低或过高均会影响转染效率）。

（2）转染前培养基更换

转染操作前，弃去原培养基，更换为 2mL 新鲜无血清 / 低血清培养基（部分试剂支持含血清培养基，需参考试剂说明书）。

（3）核酸与脂质体溶液制备

• DNA 溶液制备：在无菌离心管中，将 4μg 质粒 DNA 加入 250μL DMEM 培养基（或 1640、MEM、F12 等基础培养基，无需添加抗生素、谷氨酰胺），用移液器轻轻吹打混匀。
  注：质粒用量可根据细胞类型调整（0.1μg-4μg），需避免剧烈涡旋导致 DNA 降解。
• 脂质体溶液制备：另取一无菌离心管，加入 6μL Lip 脂质体转染试剂至 250μL DMEM 培养基中，轻轻混匀后室温孵育 5 分钟（脂质体用量通常为质粒体积的 1-2 倍，即质粒：脂质体 = 1:1-1:2，需根据细胞类型优化）。

（4）复合物形成

将 DNA 溶液与脂质体溶液缓慢混合，轻轻吹打 3-5 次（勿涡旋或离心），室温孵育 20 分钟，此时溶液中可能出现轻微絮状沉淀，为正常现象，不影响转染效果。

（5）复合物加入与培养

将 500μL 核酸 - 脂质体复合物缓慢滴加至六孔板的细胞孔中，轻轻摇晃培养板呈 “8” 字形混匀。

• 贴壁细胞：直接放回 37℃培养箱继续培养；
• 悬浮 / 半悬浮细胞：加复合物后密封培养板，以 200g 低速平角离心 1.5 小时，再放回培养箱培养 6 小时后更换培养基。

（6）培养基更换与后续观察

转染后 6-12 小时，弃去含复合物的培养基，更换为完全培养基（含血清和抗生素）继续培养。

• 瞬时表达检测：转染后 24-40 小时可通过荧光显微镜观察 GFP 等报告基因表达，评估转染效率；
• 稳定细胞株构建：转染 24 小时后加入筛选药物（如 G418、嘌呤霉素），持续筛选 2-4 周获得稳定株。

二、物理转染：电穿孔原理与关键操作

物理转染技术中，电穿孔因适用性广（可用于细菌、酵母、动物细胞等）、无载体限制而被广泛应用，但其对细胞活力影响较大，需严格优化参数。

1. 核心原理

电穿孔通过向细胞悬液施加短时间的高压电脉冲，使细胞膜脂质双层结构发生瞬时重排，形成纳米级小孔。外源核酸可通过这些小孔进入细胞，随后细胞膜自我修复，维持细胞存活。该过程的核心是通过电脉冲 “物理突破” 细胞膜屏障，实现核酸导入。

2. 关键影响因素

电穿孔效率和细胞存活率受多种参数影响，实验中需重点优化：

• 电场强度（kV/cm）：过高导致细胞死亡，过低则转染效率低；
• 脉冲时间与次数：通常为毫秒级单次或多次脉冲，需根据细胞类型调整；
• 转染介质：需低离子强度缓冲液（避免电脉冲时产生过多热量）；
• 核酸浓度与构象：线性 DNA 与超螺旋 DNA 转染效率存在差异。

3. 基本操作流程

（1）细胞与核酸准备

收集对数生长期细胞，用无血清培养基或电穿孔专用缓冲液洗涤 2 次，调整细胞浓度至 1×10⁶-1×10⁷个 /mL；将外源核酸（DNA/RNA）稀释至合适浓度（通常 1-5μg / 反应），与细胞悬液混合。

（2）电穿孔仪设置

根据细胞类型预设参数（可参考仪器说明书或文献的推荐值，如 HEK293 细胞常用 200-300V 电压、500μF 电容），准备电穿孔杯（常用 0.2cm 或 0.4cm 间隙）。

（3）电穿孔操作

将细胞 - 核酸混合液加入电穿孔杯，避免气泡；将电穿孔杯放入仪器槽中，触发电脉冲；脉冲结束后，静置 1-2 分钟，将细胞悬液转移至含完全培养基的培养板中培养。

（4）后续优化

转染后 24-48 小时检测转染效率，根据结果调整电场强度、脉冲时间等参数，平衡效率与细胞存活率。

三、病毒转染：慢病毒载体转染原理与步骤

病毒转染凭借高转染效率、可稳定整合外源基因等优势，在难转染细胞（如干细胞、原代细胞）中应用广泛，其中慢病毒载体因安全性较高、宿主范围广而成为主流选择。

1. 核心原理

慢病毒属于逆转录病毒科，其基因组为 RNA。转染过程中，慢病毒通过表面包膜蛋白与细胞表面受体结合，进入细胞后释放 RNA，经逆转录形成 cDNA，随后整合至宿主细胞染色体中，实现外源基因的长期稳定表达。慢病毒可感染分裂期和非分裂期细胞，且免疫原性低，对细胞毒性小。

2. 实操步骤（以慢病毒转染贴壁细胞为例）

（1）细胞接种

转染前 18-24 小时，将贴壁细胞以 1×10⁵个 / 孔的密度接种至 24 孔板，确保转染时细胞密度达到 2×10⁵个 / 孔左右（汇合度约 50%-60%）。

（2）病毒悬液添加

转染当天，弃去原培养基，更换为含 6μg/mL polybrene（聚凝胺，可增强病毒与细胞的结合）的新鲜培养基 2mL；按 multiplicity of infection（MOI，感染复数）加入适量慢病毒悬液，轻轻混匀后置于 37℃培养箱孵育。
注：对 polybrene 敏感的细胞，孵育 4 小时后需补加 2mL 新鲜培养基稀释，降低毒性。

（3）培养基更换

孵育 24 小时后，弃去含病毒的培养基，更换为完全培养基继续培养。

（4）后续检测与筛选

• 荧光观察：若病毒携带荧光报告基因（如 GFP），转染后 48 小时可观察到荧光表达，72 小时表达量达到高峰；
• 效率检测：转染 72-96 小时可通过流式细胞术（FACS）定量检测转染效率；
• 稳定株筛选：若病毒携带抗性基因（如 Neoᵣ、Puroᵣ），转染后 3-4 天加入对应筛选药物，持续筛选 1-2 周获得稳定细胞株。

总结

三种转染技术各有优势与适用场景：脂质体转染操作简便，适合常规细胞的瞬时转染；电穿孔无载体限制，适合多种细胞类型但需优化参数；慢病毒转染效率高，适合难转染细胞及稳定株构建。实验中需根据细胞类型、实验目的及成本选择合适方法，并通过优化关键参数（如试剂比例、电脉冲强度、MOI 值）提升转染效果。

实验操作中需严格遵循无菌原则，注重细节控制（如细胞状态、试剂孵育时间），以确保实验稳定性与重复性。