Western Blot（蛋白质免疫印迹）--实验操作015
Western Blot（蛋白质免疫印迹）原理与实验步骤详解
原理
Western Blot（WB）是一种用于分离、检测和分析特定蛋白质的实验技术。它结合了SDS-PAGE电泳分离与抗原-抗体特异性结合的原理。
SDS-PAGE电泳：SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）用于根据蛋白质分子量的大小分离样本中的蛋白质。样本在电场中迁移，较小的蛋白质会更快地移动，而较大的蛋白质则会慢些，形成不同的条带。
转膜（Blotting）：电泳分离后的蛋白条带被转移到固相介质（通常是聚偏二氟乙烯膜，PVDF膜）上，转膜的过程中，蛋白质通过电场的作用转移到膜的表面，并以非共价键形式吸附在膜上。
抗原-抗体反应：一旦蛋白质被转移到膜上，使用针对特定蛋白的抗体进行孵育。该抗体具有高度的特异性，能够与目标蛋白质结合，从而实现目的蛋白的检测。
检测：使用二抗（通常是酶标二抗）与酶底物反应，二抗上偶联的酶（如辣根过氧化物酶HRP）会降解底物，产生可见的发光信号或有色沉淀物。通过化学发光或显色反应，结合影像分析软件，能够定量和定性分析目标蛋白的表达。
WB实验步骤
制胶与上样
制胶：根据说明配制SDS-PAGE胶，确保凝胶完全凝固。将胶装入内槽，加入1×电泳液，确保电泳槽无漏液。
上样：使用10–20 μL的蛋白样本，确保样品均匀加入样品孔。
电泳分离
将电泳槽放置在电泳仪中，设定电压为150 V，运行1小时，直到溴酚蓝指示剂接近胶底。
转膜
转膜缓冲液准备：将转膜缓冲液冷却至4℃，浸泡PVDF膜30秒后，用去离子水（ddH₂O）冲洗。
膜与凝胶的准备：撬开玻璃板，切除浓缩胶，确保转膜过程无气泡。将膜与凝胶按顺序夹在滤纸和海绵之间，放入转膜槽中，确保膜靠近正极，凝胶靠近负极。
转膜条件：设置恒流200–400 mA，运行1小时。
封闭
将转移后的PVDF膜放入5%脱脂牛奶或BSA（使用TBST配制的封闭液）中，摇床上封闭1–2小时（可选择4℃过夜或37℃快速封闭30分钟）。
抗体孵育
一抗孵育：将一抗稀释在TBST中，配合5%奶粉或BSA，4℃过夜孵育。
洗膜：用TBST洗膜3次，每次5–10分钟。
二抗孵育：将HRP标记的二抗稀释在TBST中，室温孵育1–2小时。
化学发光检测
将膜浸入化学发光工作液中，并用化学发光仪进行检测。根据图像分析软件的结果，定量分析蛋白表达量。
实验注意事项
低温操作：为了防止蛋白降解，所有的操作（如蛋白提取、离心、转膜）需要在4℃下进行。
抗体存储：抗体使用后应低温保存，避免反复冻融。
膜的处理：PVDF膜避免用手直接接触，以免污染。
封闭与洗膜：封闭液需要使用新鲜配置，洗膜应确保彻底，以去除非特异性结合的抗体。
电泳与转膜的精度：记录每个实验步骤的关键参数（如电压、电流、时间、抗体批号、稀释倍数等），确保实验的可重复性和准确性。
扩展应用与最新进展
Western Blot技术已广泛应用于许多领域，包括癌症研究、细胞生物学、免疫学及药物研发等。随着技术的发展，近年来出现了一些新的进展和应用：
高通量蛋白质检测：结合现代化学发光或荧光标记技术，可以在同一膜上同时检测多种蛋白，极大地提高了实验的通量和效率。
便捷的膜选择：目前，除传统的PVDF膜外，尼龙膜和其他类型的膜也广泛应用于Western Blot实验中，根据目标蛋白和实验条件选择合适的膜。
定量分析软件：新的影像分析软件提供更为精确的定量结果，可以自动化分析蛋白表达量，减少人工误差。
新型抗体与偶联试剂：随着抗体生产技术的进步，市面上出现了更为特异性和高亲和力的抗体，配合最新的酶标记和荧光标记技术，可以提高实验灵敏度和准确性。
结论
Western Blot是一种高效、可靠的蛋白质检测技术，通过精准的蛋白分离、电泳转膜、抗体特异性结合以及信号检测，为蛋白质的定量分析提供了强有力的支持。随着技术的不断发展，它在生命科学和医学研究中的应用前景更加广阔。