过氧化物酶的邻近标记技术（APEX）：最灵敏的蛋白互作方法
在生物医学领域，蛋白质作为生命活动的核心分子，其相互作用、动态变化以及精准定位对于揭示细胞的生理功能和病理机制至关重要。然而，传统的蛋白质研究方法往往存在诸多局限性，难以捕捉蛋白质在复杂细胞环境中的真实状态和瞬时事件。近年来，基于过氧化物酶的邻近标记技术（APEX）应运而生，这一创新性技术为蛋白质研究开辟了全新的视角和途径。它以独特的优势和原理，成为探索蛋白质世界的重要工具。
基于过氧化物酶的邻近标记技术的发展历程可追溯至2012年，Alice Ting实验室从二聚豌豆或大豆抗坏血酸过氧化物酶中提取了APEX，最初用作电子显微镜的报告基因，2013年首次将其用于邻近标记空间蛋白质组学和鉴定细胞中时空特异的分子组分，由此开启了该技术在蛋白互作研究等领域的大门。2014年，该实验室通过定向进化将APEX升级为活性更高的 APEX2，其在热稳定性、生物素化活性等方面表现更佳，并且在电子显微镜应用中更敏感，可实现跨大视野染色，还可用于蛋白酶可及性测试或蛋白印迹法等，进一步拓展了该技术的应用范围和精度。
一、APEX技术的原理
基于过氧化物酶的邻近标记技术的原理是将过氧化物酶与目标蛋白融合表达，在过氧化氢存在的情况下，过氧化物酶能够催化生物素-酚等底物形成自由基，这些自由基具有高反应活性，可与标记半径内的邻近蛋白质的特定氨基酸残基反应，形成共价加合物，从而实现对邻近蛋白质的标记。
基于过氧化物酶的邻近标记原理
二、APEX技术的步骤
- 构建融合蛋白及细胞转染：将过氧化物酶基因（APEX）与目标蛋白基因进行融合，构建相应的表达载体，将构建好的融合蛋白表达载体转染至合适的细胞中，使融合蛋白在细胞内表达。
- 添加底物和过氧化氢：向细胞中添加生物素 - 酚等底物和过氧化氢，启动邻近标记反应。一般根据具体实验需求和所选用的过氧化物酶类型，确定合适的底物和过氧化氢浓度，以及反应时间。
- 终止反应并处理细胞：反应结束后，通过加入适量的终止缓冲液等方法终止反应。随后对细胞进行洗涤，以去除未反应的底物和过氧化氢等成分，然后收集并裂解细胞，提取标记后的蛋白质。
- 富集和鉴定标记蛋白：利用链霉亲和素珠等工具，结合生物素 - 亲和素之间的特异性相互作用，富集被生物素标记的蛋白质，最后通过质谱等分析手段对富集到的蛋白质进行鉴定和分析。
基于过氧化物酶的邻近标记步骤
三、APEX技术的应用
- 研究蛋白质相互作用：能够在活细胞内实时捕捉蛋白质之间的瞬时或微弱相互作用，为研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-小分子等相互作用提供了有力工具，有助于揭示细胞内复杂的信号转导通路、代谢过程以及蛋白质复合物的生成等生物学过程。
- 解析亚细胞结构和蛋白质定位：通过将过氧化物酶与特定的细胞器标记蛋白融合表达，可以对特定亚细胞区域的蛋白质进行原位标记和分析，从而精确确定蛋白质的亚细胞定位，以及研究细胞器之间的相互作用和物质交换等。
- 药物靶标发现：有助于鉴定与疾病相关的关键蛋白质相互作用和细胞器相关蛋白，从而为药物研发提供潜在的靶点蛋白，加速药物发现的进程。
四、APEX技术的优势
- 高时空分辨率：能够在细胞内的特定位置和特定时间窗口内进行标记，精确地捕捉蛋白质在细胞内的动态变化和相互作用，为研究蛋白质在细胞生理过程中的实时行为提供了高分辨率的信息。
- 操作相对简便：与一些传统的蛋白质相互作用研究方法相比，如免疫共沉淀等，基于过氧化物酶的邻近标记技术无需复杂的步骤和繁琐的操作，且对实验条件的要求相对较低，易于在多种细胞类型和实验体系中应用。
- 灵敏度高：能够检测到低丰度的蛋白质相互作用和瞬时相互作用，有助于发现一些传统方法难以捕获的生物分子事件，为深入研究细胞内的生物学过程提供了更全面、更准确的信息。
- 与多种分析技术兼容：标记后的蛋白质可以与质谱分析、蛋白质芯片、Western blot等多种分析技术相结合，进一步实现对蛋白质的定性和定量分析，以及功能研究等。
五、APEX技术的局限性
- 对过氧化氢的依赖及细胞毒性问题：传统的基于过氧化物酶的邻近标记技术通常需要外源添加过氧化氢来启动标记反应，而过氧化氢可能会对细胞产生一定的毒性和氧化应激，影响细胞的正常生理状态，甚至导致细胞损伤或死亡，从而限制了该技术在活体动物等长期实验中的应用。
- 对融合蛋白表达水平和细胞状态的影响：过氧化物酶与目标蛋白的融合表达可能会对目标蛋白的正常表达、折叠、功能以及细胞内的代谢过程等产生一定的干扰，从而影响实验结果的准确性和可靠性，因此需要对融合蛋白的表达水平和细胞状态进行严格控制和监测。
六、总结
基于过氧化物酶的邻近标记技术作为一种前沿的蛋白互作研究工具，在生物医学领域展现出了巨大的潜力和价值。从早期的APEX到如今的多种衍生技术，每一次改进都为研究提供了更强大的功能和更广阔的视野，其原理和操作步骤的阐述，让我们清晰地了解到这一技术如何精准地捕捉蛋白质的邻近信息，为揭示蛋白质相互作用和细胞内复杂网络提供了独特手段。在应用方面，该技术已广泛涉及蛋白质相互作用研究、亚细胞结构解析、细胞外蛋白质组分析以及药物靶标发现等多个重要领域，推动了相关研究的不断进步。尽管其具有诸多优势，但也存在一些局限性，然而，正是这些局限性也为未来的改进和优化指明了方向。随着技术的不断发展和完善，相信基于过氧化物酶的邻近标记技术将在蛋白质研究领域发挥更为关键的作用。