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单细胞转录组（3）

news 来源：原创 2025/5/18 6:02:34

1. 安装软件

为了进行单细胞测序数据分析，需要安装一系列专业的软件工具。以下是一些常用的软件及其安装方法：

1.1 Cell Ranger 下载安装（需注册）

Cell Ranger 是 10x Genomics 提供的官方数据分析软件，它支持从原始测序数据（FASTQ 或 BCL 格式）到基因表达矩阵的生成，并提供聚类、降维等分析功能。

访问下载地址：
- Cell Ranger 官方下载页面
- 您需要注册账号并登录才能下载。
安装步骤：
1. 访问上述链接，注册账号并登录。
2. 根据操作系统选择合适的版本下载。
3. 解压下载的文件，并按照安装说明进行安装。
4. 安装完成后，可以通过命令行运行 cellranger --version 来验证安装是否成功。

1.2 Loupe Browser 下载（需注册）

Loupe Browser 是 10x Genomics 提供的可视化工具，用于查看和分析 Cell Ranger 生成的结果文件（如 .cloupe 文件）。

访问下载地址：
- Loupe Browser 官方下载页面
- 您需要注册账号并登录才能下载。
安装步骤：
1. 访问上述链接，注册账号并登录。
2. 根据操作系统选择合适的版本下载。
3. 安装完成后，启动 Loupe Browser 并按照提示进行配置。

1.3 bcl2fastq

bcl2fastq 是 Illumina 提供的软件，用于将 BCL 格式的测序数据转换为 FASTQ 格式，这是单细胞测序数据分析的前置步骤。

访问下载地址：
- Illumina bcl2fastq 下载页面
安装步骤：
1. 访问上述链接，下载对应版本的软件。
2. 解压下载的文件，并按照安装说明进行安装。
3. 安装完成后，可以通过命令行运行 bcl2fastq --version 来验证安装是否成功。

1.4 其他软件

除了上述软件，还可能需要安装一些其他工具，例如用于比对的 STAR、用于定量的 featureCounts 等。可以通过以下命令安装这些工具（使用 Conda 环境管理工具）：

mamba install -y star featurecounts samtools r-seurat umi_tools

2. 下载参考序列

为了进行单细胞测序数据分析，需要使用参考基因组。参考基因组提供了基因组的背景信息，这对于比对测序数据和定量基因表达至关重要。10x Genomics 提供了针对不同物种的参考基因组，可以直接用于 Cell Ranger 分析。

2.1 访问下载地址

您可以通过以下链接访问 10x Genomics 参考基因组下载页面：
- 10x Genomics 参考基因组下载页面

2.2 下载参考基因组

人类参考基因组（GRCh38）：
- 您可以通过以下命令下载人类参考基因组（GRCh38）：
```
curl -O "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz"
```
小鼠参考基因组（GRCm39）：
- 您可以通过以下命令下载小鼠参考基因组（GRCm39）：
```
curl -O "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCm39-2024-A.tar.gz"
```
大鼠参考基因组（mRatBN7.2）：
- 您可以通过以下命令下载大鼠参考基因组（mRatBN7.2）：
```
curl -O "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mRatBN7-2-2024-A.tar.gz"
```

2.3 解压下载的文件

下载完成后，您需要解压缩下载的文件到指定目录。这通常可以通过以下命令完成：
```
tar -xzf refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz -C /path/to/installation/directory
```
- 请将 /path/to/installation/directory 替换为您希望解压缩文件的实际路径。

3. 自建参考序列

对于非模式物种或者当需要特定版本的参考基因组时，研究人员可能需要自己构建参考基因组。以下是构建参考基因组的一般步骤：

3.1 斑马鱼参考基因组构建

以斑马鱼（zebrafish）为例，说明如何构建参考基因组：

下载基因组序列：

wget http://ftp.ensembl.org/pub/release-105/fasta/danio_rerio/dna/Danio_rerio.GRCz11.dna.primary_assembly.fa.gz
gunzip Danio_rerio.GRCz11.dna.primary_assembly.fa.gz

这一步下载斑马鱼的基因组序列。

下载GTF文件：

wget http://ftp.ensembl.org/pub/release-105/gtf/danio_rerio/Danio_rerio.GRCz11.105.gtf.gz
gunzip Danio_rerio.GRCz11.105.gtf.gz

这一步下载斑马鱼的GTF（Gene Transfer Format）文件，它包含了基因的注释信息。

过滤GTF文件：

cellranger mkgtf Danio_rerio.GRCz11.105.gtf Danio_rerio.GRCz11.105.filtered.gtf --attribute=gene_biotype:protein_coding

使用Cell Ranger 的 mkgtf 命令过滤GTF文件，只保留编码蛋白的基因。

构建参考序列：

cellranger mkref --genome=Danio_rerio --fasta=Danio_rerio.GRCz11.dna.primary_assembly.fa --genes=Danio_rerio.GRCz11.105.filtered.gtf

使用Cell Ranger 的 mkref 命令构建参考序列。

3.2 猕猴基因组构建

对于猕猴（Rhesus macaque）等其他物种，步骤与斑马鱼类似，需要下载对应的基因组序列和GTF文件，然后进行过滤和构建参考序列。

3.3 大鼠参考基因组构建

对于大鼠（Rattus norvegicus）等物种，同样的流程适用。需要下载大鼠的基因组序列和GTF文件，过滤GTF文件，最后构建参考序列。

4. 下载练习数据

为了熟悉单细胞测序数据分析流程，可以使用10x Genomics提供的练习数据。这些数据通常来自已发表的文章，可以直接用于学习和练习。

4.1 访问下载地址

您可以通过以下链接访问10x Genomics数据下载页面：
- 10x Genomics 数据下载页面

4.2 下载练习数据集

练习数据集通常包括原始测序数据（FASTQ格式）、参考基因组以及分析结果文件（如.cloupe文件）。
您需要注册并登录10x Genomics网站，然后根据研究类型、试剂版本和流程版本筛选并下载所需的数据集。

4.3 下载示例

以下是下载练习数据的示例命令：

# 下载原始测序数据（FASTQ格式）
wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_1k_v3/pbmc_1k_v3_fastqs.tar# 下载比对排序后的BAM文件
wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_1k_v3/pbmc_1k_v3_possorted_genome_bam.bam# 下载分析结果文件（.cloupe格式）
wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_1k_v3/pbmc_1k_v3_molecule_info.h5
wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_1k_v3/pbmc_1k_v3_filtered_feature_bc_matrix.h5