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单细胞转录组（2）单细胞测序原理

news 来源：原创 2025/5/18 5:59:12

1. 细胞捕获分选技术

单细胞捕获分选方法
a微吸管分离
b显微镜辅助毛细管捕获
c荧光标记细胞分选（ FACS
d激光捕获显微分离 (
e微流控
f抗体磁珠分选 MACS
g微液滴

单细胞测序的关键在于如何进行单细胞的捕获和分选，这是决定单细胞检测成本和通量的关键步骤。不同的单细胞测序平台主要差别也在于单细胞捕获分选的方法。

1.1 细胞分选技术

在这里插入图片描述

细胞分选技术可以分为特异性分选和非特异性分选两大类：

特异性分选：
- 微吸管分离：通过显微操作技术，用微吸管手动挑选单个细胞。
- 激光捕获显微分离（LCM）：利用激光将目标细胞从组织切片中分离出来。
- 荧光激活细胞分选（FACS）：基于细胞表面荧光标记物，通过流式细胞仪分选目标细胞。
- 抗体磁珠分选（MACS）：利用抗体偶联的磁珠，通过磁场分选目标细胞。
- 优点：能够精确分选目标细胞。
- 缺点：通量低，依赖已知标记物，成本高，操作复杂。
非特异性分选：
- 微流控技术：通过微流控芯片的微通道和微腔室，将单细胞分离并捕获。
- 微液滴技术：将单细胞和反应试剂包裹在纳米级液滴中，每个液滴包含一个细胞和一个带有条形码的珠粒。
- 微孔技术：利用蜂窝板上的微孔，让单细胞悬液流过并落入微孔中。
- 优点：通量高，适合大规模单细胞测序。
- 缺点：无法特异性分选目标细胞，需要后续分析筛选。

1.2 特异性分选类技术（低通量）

早期单细胞测序技术（如SMART-seq）主要基于特异性分选，但存在以下局限：

细胞分选效率低，一次只能分选少量细胞。
依赖已知标记物，难以发现新的细胞类型。
检测成本高，不适合大规模研究。

1.3 非特异性分选类技术（高通量）

目前主流的单细胞测序平台（如10x Genomics、BD Rhapsody）均采用非特异性分选技术，能够一次捕获数千个细胞，大大提高了通量和效率。

2. 不同单细胞测序平台比较

单细胞测序平台的选择取决于实验需求、预算以及研究目标。不同的平台在通量、成本、操作复杂性以及数据分析难度等方面存在显著差异。以下是一些常见单细胞测序平台的比较：

技术类型	代表性技术	通量	优点	缺点
微流控芯片	Fluidigm C1	96个细胞/芯片	通量适中，适合少量细胞的高精度分析	通量有限，成本较高
微液滴	10x Genomics	3000-8000个细胞/芯片	高通量，适合大规模单细胞测序	数据复杂，分析难度大
微孔技术	BD Rhapsody	20万+微孔	高通量，适合大规模单细胞测序	操作复杂，成本较高

2.1 微流控芯片技术

代表性技术：Fluidigm C1
通量：一次最多可以捕获96个单细胞。
优点：
- 高精度：适合对少量细胞进行高精度的分析。
- 自动化程度高：操作相对简单，适合实验室常规使用。
缺点：
- 通量有限：一次只能处理96个细胞，对于大规模研究不够用。
- 成本较高：芯片成本较高，不适合大规模单细胞测序。

2.2 微液滴技术

代表性技术：10x Genomics
通量：一次可以处理3000-8000个单细胞。
优点：
- 高通量：能够一次处理数千个单细胞，适合大规模研究。
- 成本较低：单个细胞的测序成本相对较低。
- 数据丰富：能够提供丰富的基因表达信息。
缺点：
- 数据分析复杂：产生的数据量大，分析难度较高。
- 多细胞污染：存在一定的多细胞污染风险，需要后续分析筛选。

2.3 微孔技术

代表性技术：BD Rhapsody
通量：蜂窝板上有20万+微孔，理论上可以处理大量单细胞。
优点：
- 超高通量：适合处理大量单细胞，适合大规模研究。
- 灵活性高：可以同时处理多个样本，适合多组学分析。
缺点：
- 操作复杂：实验操作较为复杂，需要专业的技术人员。
- 成本较高：设备和耗材成本较高。

3. 10x Genomics 单细胞测序技术

10x Genomics 是目前最主流的单细胞测序平台之一，其核心技术包括 GEM（Gel Beads-in-Emulsion）、Barcode 和 UMI（Unique Molecular Identifier）。这些技术的结合使得 10x Genomics 平台能够实现高通量、低成本的单细胞测序。

3.1 GEM（Gel Beads-in-Emulsion）

在这里插入图片描述

GEM 结构：
图中展示的是10x Genomics单细胞测序技术中使用的GEM（Gel Beads-in-Emulsion，凝胶珠-油包水）结构。GEM是10x Genomics单细胞测序技术的核心组成部分，它允许在单个细胞水平上进行基因表达的捕获和测序。

凝胶珠（Gel Bead）：这是一个微小的凝胶珠，内部包含有用于后续逆转录和扩增的引物。
10x Barcode：这是一段16个碱基对（nt）的独特序列，每个凝胶珠上的Barcode都是唯一的，用于在测序后区分来自不同细胞的RNA分子。
UMI（Unique Molecular Identifier，独特分子标识符）：这是一段12个碱基对的序列，用于在同一个细胞内区分不同的转录本，并在后续分析中去除PCR扩增过程中产生的重复序列，从而实现更准确的基因表达定量。
Poly(dT)引物：这是一段30个碱基对的poly(dT)序列，用于捕获细胞中的mRNA分子。mRNA的poly(A)尾巴会与poly(dT)引物结合，从而使得mRNA模板可以被逆转录成cDNA。

在单细胞测序过程中，每个细胞被包裹在自己的GEM中，这样每个细胞的mRNA分子都会被逆转录并加上特定的Barcode和UMI。这个过程发生在油包水的液滴中，每个液滴相当于一个微型反应室。随后，这些液滴被打破，释放出含有cDNA的凝胶珠，这些cDNA可以被进一步扩增并准备进行高通量测序。

作用：
- 每个 GEM 中的细胞独立进行裂解、反转录和扩增，最终形成单细胞测序文库。
- 通过 Barcode 和 UMI，可以将测序结果拆分到单个细胞，并去除 PCR 重复。

3.2 Barcode

Barcode 是一段 14-16bp 的标签序列，每个 GEM 中的 Barcode 不同，用于区分不同的细胞。10x Genomics 平台每次反应可以投入约 75 万个 GEM，远远大于细胞数目。

作用：
- 通过 Barcode 序列，可以将测序结果拆分到单个细胞。
- 每个细胞的 Barcode 唯一，用于标记细胞来源。
特点：
- Barcode 序列在测序过程中用于区分不同细胞的转录本。
- 10x Genomics 芯片同时可以上样 8 个文库，不同文库可以使用相同的 Barcode，但为了保证整合多个文库时 Barcode 不发生冲突，通常会在 Barcode 后面加一个数字标记其来源的文库。

3.3 UMI（Unique Molecular Identifier）

UMI 是单分子识别码，长度为 10-12bp，用于区分同一细胞中的不同转录本并去除 PCR 重复。

作用：
- 通过 UMI，可以准确计算基因表达量，避免 PCR 扩增带来的偏差。
- UMI 在 cDNA 分子扩增前加入，用于识别并去除技术重复。
特点：
- UMI 测序可以在 PCR 扩增之前标记每个分子，从而在后续分析中区分真实信号和 PCR 重复。
- UMI 的使用提高了基因表达定量的准确性和可靠性。
- 先根据barcode区分细胞，然后根据umi去除重复

3.4 GEM 与 Barcode 以及 UMI 之间的关系

GEM 是反应体系：包含 Barcode 和 UMI。
不同 GEM 中的 Barcode 不同：用于区分不同的细胞。
同一 GEM 中的 UMI 不同：用于区分同一细胞中的不同转录本。
Barcode 代表细胞：用于标记细胞来源。
UMI 代表测序 reads：用于标记单个转录本。

总结

10x Genomics 单细胞测序技术通过 GEM、Barcode 和 UMI 的结合，实现了高通量、低成本的单细胞测序。这些技术的结合不仅提高了单细胞测序的通量，还提高了数据的准确性和可靠性。10x Genomics 平台因其高效性和经济性，已成为单细胞测序领域的主流选择。

4. 10x Genomics 单细胞测序文库构建及测序

10x Genomics 单细胞测序技术是一种革命性的方法，它通过将每个单细胞封装在独立的油滴中，与凝胶珠（GEM）结合，从而实现高通量、高效率的单细胞测序。以下是详细的文库构建及测序步骤：

4.1 文库构建步骤

单细胞悬液制备：首先，需要从组织或细胞样本中制备出高质量的单细胞悬液。这一步骤对后续分析的准确性至关重要。
细胞计数和活率检测：调整细胞浓度至700-1200个细胞/μL，并确保细胞活率高于80%，以保证测序结果的可靠性。
GEM生成：利用微流控芯片技术，将带有唯一Barcode和UMI序列的凝胶珠与单细胞一起包裹在油滴中，形成GEM结构。每个GEM包含一个单细胞、一个凝胶珠和一个油滴。
细胞裂解和反转录：在油滴中，细胞被裂解，释放的mRNA与凝胶珠上的Barcode和UMI序列相连，进行逆转录反应形成cDNA。

1：PolyA+ RNA捕获

过程：这条mRNA分子的3’端有一个polyA尾巴。我们使用带有寡聚T（polyT）的磁珠来捕获这个polyA尾巴，从而将这条mRNA从细胞中的所有RNA分子中分离出来。
结果：我们成功捕获了这条mRNA分子。

2：RNA片段化和引物结合

过程：捕获的mRNA分子被切割成较小的片段（例如200-300个核苷酸）。然后，我们使用随机引物或oligo(dT)引物与这些RNA片段结合，为后续的反转录做准备。
结果：每个RNA片段都与一个引物结合，准备进行反转录。

3：第一条链cDNA合成

过程：反转录酶使用引物和四种脱氧核苷酸（dNTPs）作为原料，根据RNA片段的序列合成第一条cDNA链。这条链是与原始mRNA序列互补的。
结果：我们得到了与原始mRNA序列互补的第一条cDNA链。

4：第二条链cDNA合成

过程：为了得到双链cDNA，我们使用DNA聚合酶合成第二条链。这个过程可能涉及到RNA模板的置换或使用RNAse H降解RNA模板，然后合成第二条cDNA链。
结果：我们得到了双链cDNA分子。

5：3’端加A和5’端修复

过程：在cDNA的3’端添加腺嘌呤（A）突出端，并对5’端进行修复，以便于后续接头的连接。
结果：cDNA分子的两端被修饰，准备好连接测序接头。

6：连接DNA测序接头

过程：在cDNA分子的两端分别连接上测序所需的接头（adapters）。这些接头包含了用于PCR扩增的引物结合位点以及测序所需的序列。
结果：cDNA分子的两端被连接上了测序接头，形成了测序文库片段。

7：连接片段的PCR扩增

过程：使用接头上的引物进行PCR扩增，以增加文库的量，准备进行高通量测序。在这个过程中，我们可能会加入条形码（barcode）以区分不同样本。
结果：我们得到了大量的测序文库片段，每个片段都带有条形码，可以区分不同的样本。

破乳和文库构建：通过破乳过程，将油滴打破，释放出含有cDNA的凝胶珠。然后，将所有cDNA混合，进行文库构建，准备进行高通量测序。
上机测序：利用Illumina测序平台进行高通量测序，获取每个细胞的基因表达信息。

4.2 10x Genomics 单细胞测序平台优势

真正单细胞测序：通过GEM技术实现真正意义上的单细胞测序。
超高细胞通量：一次可检测500-80000个细胞，适合大规模研究。
细胞捕获效率高：单细胞捕获效率高达65%，能够准确鉴别稀有细胞类型。
细胞可适性高：对细胞大小和类型无限制，适用于多种细胞类型。
多态率低：多态率（包含多个细胞的GEM）低于0.9%/1000细胞，保证了数据的准确性。
时间周期短：从细胞悬液到cDNA文库构建的整个过程可以在1天内完成。
性价比高：单个细胞的测序成本低，适合大规模应用。

5. 10x Genomics 单细胞测序平台优势

10x Genomics 单细胞测序平台因其独特的设计和高效的工作流程，在单细胞测序领域中占据了重要地位。以下是该平台的主要优势：

5.1 真正单细胞测序

10x Genomics 技术通过微流体“双十字”交叉系统分选单个细胞，并通过 barcode 磁珠-单细胞-油滴的对应关系形成 GEM（Gel Beads-in-emulsion），实现真正意义上的单细胞测序。这种方法确保了每个细胞的基因表达数据都是独立捕获和分析的，从而提高了数据的准确性和可靠性。