线粒体靶向压电催化剂调控焦亡与胞葬作用以增强骨肉瘤免疫原性死亡
骨肉瘤作为最常见的原发性恶性骨肿瘤，其免疫抑制性肿瘤微环境（TME）是导致传统干预手段效果受限的核心原因。诱导免疫原性细胞死亡（ICD）并抑制 TAMs 的胞葬功能，成为重塑骨肉瘤 TME 的关键突破口。
焦亡作为 ICD 的重要形式，与凋亡的本质区别在于其伴随细胞膜破裂及大量促炎分子释放，可有效激活系统性免疫应答。研究证实，线粒体损伤通过释放细胞色素 C 能高效激活 caspase-3，进而启动 caspase-3/GSDME 轴介导的非经典焦亡通路。与此同时，TAMs 的胞葬能力与其线粒体代谢密切相关：这类细胞主要通过上调线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）产生 ATP，同时降低糖酵解活性，从而增强吞噬功能；而通过增加线粒体活性氧（mtROS）破坏线粒体功能，可削弱 TAMs 的胞葬能力，促使肿瘤细胞从凋亡向免疫原性更强的继发性坏死转化。基于此，本研究设计了一种线粒体靶向压电催化剂 BFO@CaO₂-TPP（BCT），通过超声触发的压电效应与 CaO₂分解的协同作用，实现对骨肉瘤细胞焦亡的诱导及 TAMs 胞葬功能的抑制。
BCT 的制备采用多步精准组装策略：首先通过水热法合成 Bi₂Fe₄O₉（BFO）纳米颗粒，将 0.3 mmol Bi (NO₃)₃・5H₂O 与 0.028 mmol 聚 acrylic 酸（PAA，Mw 5000）溶于 20 mL 去离子水，室温搅拌 1 h 后加入 0.6 mmol Fe (NO₃)₃・9H₂O 继续搅拌 1 h，滴加 20 mL 1.25-1.4 wt% 氨水形成深棕色溶液，转入聚四氟乙烯反应釜中 180℃水热反应 24 h，离心洗涤后获得 BFO。随后通过原位负载法制备 BFO@CaO₂（BC）：将 900 mg CaCl₂与 2.4 g PAA 溶于 60 mL 去离子水，加入 30 mL 1 mg/mL BFO 悬液，超声 30 min 后加入 1.2 mL 30 wt% H₂O₂，搅拌 30 min 后离心收集产物并分散于 DMSO 中。线粒体靶向分子 DSPE-PEG-TPP 的合成则通过活化偶联反应实现：44.3 mg（4 - 羧丁基）三苯基溴化膦（TPP）经 N-(3 - 二甲基氨基丙基)-N'- 乙基碳二亚胺盐酸盐与 N - 羟基琥珀酰亚胺活化 2 h 后，与 500 mg DSPE-PEG-NH₂（Mw 5000）的 DMSO 溶液反应 24 h，经截留分子量 3500 的透析袋透析 24 h 并冻干。最终 BCT 的制备通过将 30 mg BC 与 90 mg DSPE-PEG-TPP 溶于 12 mL DMSO，搅拌 1 h 后加入 60 mL 去离子水超声 30 min，离心洗涤后获得；作为对照的 BFO@TPP（BT）则省略 CaO₂负载步骤。Cy5 标记的纳米颗粒通过 EDC/NHS 活化法制备，5 mg BC 或 BCT 与 0.2 mg EDC、0.12 mg NHS 室温反应 1.5 h，加入 200 pg Cy5-NH₂避光反应 24 h，14500 rpm 离心收集沉淀并洗涤。
材料表征采用多维度分析技术验证结构与性能：透射电子显微镜（TEM）显示 BCT 呈片状形貌，能量色散 X 射线光谱（EDS）元素映射证实 Bi、Fe、O、Ca 元素均匀分布；X 射线光电子能谱（XPS）证实 BFO 中 Bi、Fe、O 元素的存在，高分辨率谱图显示 Fe 2p 峰在超声处理后结合能降低 0.29 eV，提示 Fe³⁺向 Fe²⁺转化增强；X 射线衍射（XRD）谱图与 Bi₂Fe₄O₉标准卡片吻合，证实晶体结构完整。压电性能通过压电原子力显微镜（PFM）评估，BFO 展现出 180° 相移的滞后回线及对称蝴蝶曲线，压电系数（d33）达 5.3 pC/N，证实其优异的压电活性。动态光散射（DLS）显示 BFO、BC、BT、BCT 的水合粒径分别为 150 nm、230 nm、180 nm、180 nm，zeta 电位依次为 - 32 mV、-23 mV、-10 mV、-16 mV，表明聚合物修饰有效调控了纳米颗粒的胶体稳定性。傅里叶变换红外光谱（FTIR）中 DSPE-PEG-TPP 特征峰的出现，证实靶向分子修饰成功。
催化性能评估通过多种探针系统开展：总 ROS 检测采用 2',7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），5 μL 20 mM DCFH-DA 溶于 0.2 mL DMSO，与 0.8 mL 10 mM NaOH 避光反应 30 min，用 9 mL 20 mM PBS（pH=6.0）终止，加入 BFO（500 pg/mL）、H₂O₂（100 pM），37℃孵育 1 h 后经 2 W/cm² 超声处理 10 min，荧光分光光度计在 488 nm 激发波长下检测。结果显示，BFO 在超声与 H₂O₂协同作用下荧光强度显著升高，且 ROS 水平随超声强度（0-2 W/cm²）递增。羟基自由基（・OH）通过亚甲蓝（MB）降解法检测，10 μg/mL MB、200 μg/mL BFO 与 1 mM H₂O₂的 PBS 溶液 37℃孵育 20 min，超声处理后检测 500-750 nm 吸收光谱，发现超声显著加速 MB 降解。超氧阴离子（O₂・⁻）与单线态氧（¹O₂）分别用二氢罗丹明 123（DHR123）与 1,3 - 二苯基异苯并呋喃（DPBF）检测，证实 BFO 在超声触发下可同时生成多种活性氧。H₂O₂浓度检测显示，CaO₂负载的 BC 与 BCT 可在水溶液中分解产 H₂O₂，其中 BCT 因聚合物包裹释放速率更温和。能带结构分析表明，BFO 的带隙能为 2.56 eV，价带（VB）与导带（CB）电位分别为 1.15 V 与 - 1.41 V（vs NHE），CB 电位负于 O₂/O₂・⁻（-0.13 V）与 Fe³⁺/Fe²⁺（0.77 V）还原电位，为压电电子介导的氧化还原反应提供热力学基础。
体外细胞实验以 K7M2 骨肉瘤细胞与 RAW 264.7 巨噬细胞为模型：吞噬实验通过流式细胞术检测 Cy5 标记 BCT 的细胞内荧光强度，发现 K7M2 细胞在 4 h 达到摄取高峰并维持 12 h 以上，且摄取量显著高于骨髓间充质干细胞（BMSCs）。细胞活力通过 CCK-8 法评估，2×10⁵个 / 孔 K7M2 细胞与不同浓度 NPs 共培养后，加入 10% CCK-8 孵育 1 h，450 nm 处检测吸光度。结果显示，BCT 的细胞抑制作用呈剂量依赖性，且显著强于 BT；200 μg/mL BCT 在超声处理后使细胞存活率降至 30%，而对 BMSCs 毒性显著较低。ROS 与 Ca²⁺检测分别采用 DCFH-DA 与 Fluo-4 探针，激光共聚焦与高内涵成像显示，BCT+US 组荧光强度最高，证实 CaO₂分解释放的 Ca²⁺与压电催化产生的 ROS 形成协同效应。线粒体损伤评估中，MitoSOX Red 染色显示 BCT+US 组 mtROS 水平最高；JC-1 探针检测发现该组绿色单体 / 红色聚集体比值显著升高，提示线粒体膜电位下降；TEM 观察显示线粒体结构破坏，嵴消失；Seahorse 代谢分析仪检测到 ECAR 升高而 OCR 降低，表明糖酵解增强、OXPHOS 受抑；高内涵成像分析线粒体长度发现，BCT+US 组 < 1 μm 与 1-2 μm 线粒体比例增加，3 μm 以上长线粒体比例减少，证实线粒体碎片化。
焦亡检测从分子、生化与形态学层面展开：qRT-PCR 检测显示，BCT+US 组 caspase-3 与 Gsdme mRNA 表达显著上调，而经典焦亡通路相关的 Nlrp3、Gsdmd、Caspase-11 无明显变化；Western blot 证实 cleaved-caspase-3 与 N 端 GSDME 片段表达升高；乳酸脱氢酶（LDH）释放量与钙网蛋白（CRT）表面暴露率在该组达到最高，且细胞出现典型的焦亡泡状结构。细胞因子检测显示，TNFα、IL-18、IL-1β、CCL2 等促炎因子分泌量显著增加，提示免疫原性增强。
在骨肉瘤类器官模型中，临床手术样本经 2 mg/mL 胶原酶 II 37℃消化 1 h，过滤后与 Matrigel 混合接种，培养基以 DMEM/F12 为基础，添加 1% 青霉素 / 链霉素、1% L - 谷氨酰胺、10 mM HEPES、B27 补充剂（不含维生素 A，1:50 稀释）、1.25 mM N - 乙酰 - L - 半胱氨酸、10 mM 烟酰胺及多种生长因子（50 ng/mL R-spondin-1、50 ng/mL EGF、50 ng/mL FGF10、10 ng/mL Noggin），同时加入 5 μM A83-01 和 10 μM Y27632（均购自 AbMole）以维持类器官干性与结构完整性。HE 染色证实类器官与原代组织形态一致，BCT+US 处理后出现大量细胞死亡与空泡化，活死染色显示死细胞比例显著升高，IHC 检测发现 GSDME 阳性区域扩大，证实焦亡发生并验证了该体系的临床转化潜力。
巨噬细胞功能调控实验中，RAW 264.7 细胞 4 h 内即可显著摄取 NPs，Seahorse 分析显示 BCT+US 处理后 ECAR 升高、OCR 降低，与骨肉瘤细胞呈现相似的代谢重编程。巨噬细胞 - 凋亡肿瘤细胞共培养模型中， confocal 观察与流式定量显示 BCT+US 组吞噬率最低，且 M1 型巨噬细胞标志物 CD80 表达升高，M2 型标志物 CD206 表达降低。Annexin V-FITC/PI 染色显示该组肿瘤细胞凋亡 / 坏死比值最低，提示胞葬抑制促使凋亡向坏死转化。此外，BCT+US 处理的肿瘤细胞可显著促进树突状细胞（DC）成熟，CD86 阳性率与 IL-12 分泌量升高，为后续免疫激活奠定基础。
体内实验以 K7M2 荷瘤小鼠为模型，Cy5.5 标记的 BCT 在肿瘤部位 4 h 达到富集高峰，24 h 仍维持较高水平，主要通过肝肾功能代谢清除。安全性评估显示，各处理组小鼠体重无显著变化，血生化与血常规指标正常，主要器官 HE 染色无明显损伤。抗肿瘤效果评估中，BCT+US 组肿瘤体积与重量最小，H&E 染色显示广泛组织损伤，TUNEL 染色证实凋亡细胞比例最高，Ki67 阳性率最低。IHC 检测显示该组 caspase-3 与 GSDME 表达最强，CD80 阳性细胞增加，CD206 阳性细胞减少。流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞发现，CD80+CD86 + 活化 DC 比例升高，CD8/CD4 T 细胞比值增加，CD107a + 细胞毒性 T 细胞（CTLs）数量增多，证实适应性免疫被有效激活。
转录组测序分析显示，BCT+US 处理后共筛选出 2931 个差异基因（turquoise 模块，MM>0.5），KEGG 富集分析发现细胞因子 - 细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路等免疫相关通路显著上调，GO 分析显示免疫受体活性、T 细胞增殖调控等功能条目异常激活。CIBERSORT 分析证实 M1 巨噬细胞、DC 与 CD8+T 细胞浸润增加，M2 巨噬细胞减少。GSEA 分析进一步发现 caspase 活性正调控、吞噬作用负调控等通路显著富集。基因表达热图显示，MERTK、CD68 等吞噬相关基因与 CTSB、LAMP1 等溶酶体功能基因下调，MFN1、FIS1 等线粒体融合分裂基因及 ATG7 等自噬基因表达改变，SOD2、GCLC 等抗氧化基因异常，从转录水平证实 BCT 通过抑制吞噬与破坏线粒体功能发挥作用。
综上，本研究构建的线粒体靶向压电催化剂 BCT，通过超声触发的压电 - Fenton 反应与 CaO₂分解的协同作用，实现了骨肉瘤细胞焦亡诱导与 TAMs 胞葬抑制的双重调控。该体系通过 mtROS 爆发与钙超载破坏线粒体功能，激活 caspase-3/GSDME 非经典焦亡通路，同时通过代谢重编程抑制巨噬细胞吞噬功能，促使凋亡向坏死转化，最终将 "冷"TME 重塑为 "热"TME。类器官与体内实验共同证实了其有效性与安全性，为骨肉瘤免疫原性增强策略提供了新的技术范式，也为压电纳米材料在肿瘤免疫微环境调控中的应用奠定了基础。