生物化学Learning Track（12）蛋白质的性质和研究方法
（本笔记基于杨荣武教授主编的《生物化学》第四版，未说明来源的配图也源于教材）
蛋白质的性质
手性
由于组成蛋白质的天然氨基酸中除了甘氨酸没有手性，其他的氨基酸都具有手性，所以蛋白质也就具有手性，那么也就具备了旋光性
紫外吸收
肽键在190-230nm处有紫外吸收区域，那么除此之外，蛋白质的三种芳香族氨基酸（Trp,Tyr,Phe）都在紫外区域有吸收峰值280nm，测定280nm的紫外吸收是对蛋白质进行定性和定量的简便方法之一。那么如果蛋白质变形了，那么一般处于蛋白质内部的这三种氨基酸（因为苯环是高度疏水的）就可能会暴露在蛋白表面，从而使得蛋白质的280nm处吸收强度增大
两性解离
这个性质仍然是由氨基酸带来的，由于带有可解离基团的氨基酸残基和肽链末端的氨基和羧基，蛋白质可以发生两性解离，同时也有等电点。但是，因为蛋白质内部的氨基酸的残基分布复杂，所以如果从理论上计算得到pI是很困难的，所以一般是采用等电聚焦或者是等电点沉淀的方式来进行测定。那么这个性质也是我们分离蛋白质的常见手段利用的原理。
那么如果蛋白质的酸性氨基酸残基较多，那么pI一般偏酸；如果蛋白质的碱性氨基酸残基较多，那么pI一般偏碱；那么如果酸性和碱性氨基酸含量相当，那么pI一般中性偏酸（因为更多的羧基是暴露在蛋白表面，但是氨基可能包埋在蛋白内部，所以酸性电离更加显著）
胶体性质
可溶性蛋白质分子大小已经达到了胶体质点的范围，分子表面有许多亲水基团（不然也不会是水溶性），可以和水分子结合形成氢键，形成让蛋白质颗粒难以彼此靠近的水化层，在非等电状态，因两性解离而带有一定的电荷，因为蛋白质浸润的环境是一样的，所以蛋白分子所带的电性也是一样的，所以蛋白分子之间因为带有同种电荷而相互排斥，稳定存在。
那么在细胞环境当中，可以通过调配亲水性蛋白质的比例和种类来实现各种流动性不同的胶体系统。
沉淀
凡是可以破坏水化层或者可以中和蛋白质表面电荷的物质都可导致溶液中的蛋白质发生沉淀
（1）盐析
在蛋白质溶液中加入一定量的盐，可以使得蛋白质溶解度降低并且沉淀析出的现象称为盐析。盐析中引入的盐离子一方面会和水分子形成水合离子，此形成过程会抢夺蛋白质水化层的水分子，同时盐中带电离子可以有效中和蛋白质表面相反的电荷，从而使得蛋白质变为既不含水化层有不带净电荷的颗粒而沉淀。
盐析时所需的盐浓度称之为盐析浓度，不同蛋白质由于表面的亲水基团丰度和分布不同，同时所带电荷的情况也不同，所以盐析浓度也不同。那么我们可以利用不同的盐析浓度来使得混合液中不同的蛋白质分级沉淀，达到分离目的，这种方法称之为分段盐析。
那么硫酸铵是最常用到的盐，一方面是因为硫酸铵在水溶液中的溶解度很高，另一方面是硫酸铵的离子体积较大，所以不会对水分子和蛋白质产生很大的牵扯作用，蛋白质沉淀过程更为温和而不会破坏蛋白质，还有就是如果采用钠离子和氯离子等细胞体系常见离子，可能就会与相应的酶结合干扰酶的功能和结构，同时也更难洗除。
对于一些嗜盐菌而言，其蛋白会更富含酸性氨基酸，从而增多表面电荷，同时形成更稳固的水化层，这样可以减弱高离子浓度给其带来的中和电性和抢夺水化层水分子的作用。
但是有时如果加入的盐浓度较低的时候，可能本身电性较弱的蛋白可以吸附这些带电粒子从而带上电性，同时可以与水分子的作用增强（由于带电粒子），导致溶解度提高
但是盐的选择需要注意，不能是重金属盐离子，否则可能会和蛋白质的活性中心集团发发生共价或者是络合作用，从而使得蛋白质失活
（2）等电点沉淀
之前有提到过，当溶液中的pH恰好是蛋白质的等电点，那么蛋白质分子就不带电性，从而可以发生沉淀
（3）有机溶剂引起的沉淀
有机溶剂主要采用的是可以与水互溶的有机溶剂，一方面溶解度更大，另一方面极性大可以抢夺蛋白质分子水化层的水分子，从而促使蛋白质沉淀。但是注意不可以加入过多的有机试剂，不然会与蛋白质分子的氢键供体和受体竞争，从而使得蛋白质变性。
变性和复性
蛋白质变性是指蛋白质受到某些理化因素的作用，其特有的三维结构受到破坏的现象。
我们要注意，我们在这之前所讲的有关于蛋白质沉淀的方式不会破坏蛋白质的结构，我们仅仅是围绕破坏水化层或者是干扰电性作用，但是不论是哪一种方式我们均没有破坏蛋白质的三维结构，但是在变形过程中，我们加入的试剂会直接影响到维持蛋白质三维结构的作用力，使蛋白质的结构变得松散，但是也不会强到可以破坏肽键、二硫键等共价键的作用（这就偏离了单纯的变形范围），那么既然我们破坏的是弱相互作用，那么在作用不大的情况下是有可能发生复性的。
那么有以下几个作用可以引发蛋白质的变性作用：
强酸强碱：强酸强碱可以干扰蛋白质的带电情况，从而破坏盐键
加热：温度升高使得蛋白质分子的热运动加剧，分子内部的弱相互作用难以维持加剧的热运动，从而使得蛋白质分子三维结构被破坏
冷却：温度降低一般是不会影响的，但是如果温度降低到一定程度，那么疏水作用就会减弱（这么理解：疏水作用其实是水分子的熵趋向于更大而导致的，但是随着温度降低，水分子的热运动较弱，溶液中的水分子和形成在疏水基团表面的水分子笼的水分子这两个状态之间的熵差减小，水分子脱离水分子笼的能力下降，所以疏水作用的根本驱动也就减弱，因此疏水作用减弱），导致蛋白质的疏水核心不稳定，三维结构被破坏。更极端的是，若温度降低到冰点，那么蛋白质内部可能形成冰晶，这也会破坏蛋白质的三维结构
有机溶剂除了之前所说的过量的极性有机溶剂可以导致变形，对于非极性溶剂或者是非极性大分子，可以结合蛋白质当中的疏水核心，干扰蛋白质分子内的疏水作用导致蛋白质变性。所以在细胞中的脂溶性分子要么是被膜包裹，要么是与特定蛋白结合，而不会是以游离态存在（脂质也很难以游离态存在于水环境中）
同时重金属盐也是可以导致变性的，不仅是可以和蛋白质分子的特定基团发生反应，也可以根据自身带有的电性，破坏蛋白质的盐键，从而破坏蛋白质的三级结构（也就因此，在使用盐即使不是重金属盐的时候，也要注意加入的量，否则可能也会干扰盐键）
那么蛋白质在变性之后，其理化性质也会出现一系列的改变
首先蛋白质的生物活性会丧失（因为结构是功能行使的基础），然后蛋白质的内部疏水基团可能会外露，使得蛋白质的水溶性下降，同时蛋白质的结构也会变得更加舒展，肽链可能伸出，从而更容易被酶水解，同时整体的黏度也增大。蛋白质也因为失去了规则的三维结构从而无法形成结晶。另外因为蛋白质内部的一些疏水基团包括芳香性的基团等，所以变形之后，蛋白质对280nm的紫外吸收强度可能也会上升。
那么在课本的生化探究中也讲到嗜热生物和嗜冷生物是如何调节蛋白质结构来适应环境的。
那么对于嗜热生物而言，主要是增强蛋白质的刚性来抵抗高温可能带来的变性；比如形成更大的疏水核心（也就是采用更多的氨基酸组成，降低蛋白质表面积和体积之比），带有更多的负电基团来形成更多的盐键，形成更多的二硫键。同时体现蛋白质柔性的环的含量也会减少，同时蛋白质中存在的环和蛋白质其他组分的作用也会加强。
但是要注意的就是，因为蛋白质的电性明显增大，那么需要一定的盐浓度来中和电荷，从而避免蛋白质分子之间因为静电作用聚合。
对于嗜冷生物而言，主要采用的方式是增强蛋白质的柔性，所以在氨基酸的组成上更加偏好于较小基团的氨基酸，同时也会减少对于刚性结构的氨基酸如脯氨酸、较大基团的氨基酸如色氨酸和带有电荷的氨基酸如精氨酸的使用
水解
蛋白质水解一般有三种常见的方式：强酸加热，强碱加热和酶水解。其中强酸加热会破坏四种氨基酸，特别是色氨酸几乎会被完全破坏，还有三种羟基氨基酸，同时Gln和Asn容易水解变为Glu和Asp，碱性水解会破坏多种氨基酸，同时产生消旋现象，因此会有D-氨基酸出现在产物中，但是不会破坏Trp。但是酶水解不仅效率高，同时不会破坏氨基酸，也不会产生消旋现象。
根据酶切的位置，我们可以把蛋白酶（有点类似于核酸酶）分为两种，一种是水解肽链内部氢键的内切蛋白酶，一种是水解肽链两端氢键的外切蛋白酶，那么外切蛋白酶由于剪切位点可以进一步分为专门水解N端肽键的氨肽酶，和水解C端肽键的羧肽酶
蛋白质的分类
蛋白质的分类标准不同，蛋白质的归属也不同，那么这里介绍四种分类标准：
按照溶解性质分类
| 蛋白名称 | 溶解性质 |
| 白蛋白（清蛋白） | 较小，能溶于水和盐溶液，可以被饱和硫酸铵沉淀 |
| 球蛋白 | 不溶于水而溶于稀盐、稀酸或者稀碱溶液，可以被半饱和硫酸铵沉淀 |
| 组蛋白 | 可以溶于水或者稀酸，是古菌和真核生物染色体的结构蛋白，富含Arg和Lys，是碱性蛋白质 |
| 精蛋白 | 易溶于水或稀酸，富含碱性氨基酸，缺乏Trp和Tyr，是碱性蛋白质 |
| 醇溶蛋白 | 溶于70%-80%的乙醇，但是不溶于水、无水乙醇或者盐溶液 |
| 谷蛋白类 | 不溶于水或者稀盐溶液，但是溶于稀酸或者稀碱 |
| 硬蛋白类 | 不溶于水、盐溶液、稀酸、稀碱，主要起支持和保护作用 |
按照化学组成分类，蛋白质又可以分为简单蛋白质和缀合蛋白质，根据非蛋白的成分，缀合蛋白质又可以分为糖蛋白（缀合糖分子），脂蛋白（缀合脂分子），核蛋白（缀合核酸），色蛋白（缀合显色分子），金属蛋白（缀合金属离子），磷蛋白（缀合磷酸基团）和黄素蛋白（缀合黄素）
根据分子形状、溶解性质以及是否与膜结合，蛋白质又分为球状蛋白、纤维蛋白和膜蛋白三大类
根据功能，蛋白质又可以分为酶蛋白、调节蛋白等等（种类太多就略了）
蛋白质的研究方法
（1）蛋白质的纯化与分离
那么如果我们无法直接得到蛋白质X的基因，我们可以通过纯化X，从而解出起一部分的氨基酸序列，然后制作基因探针，就可以从基因组当中“钓”出目的基因。
那么如果我们可以得到纯化的X，那么我们可以通过免疫动物得到抗体，然后我们在cDNA文库当中表达全部蛋白中去看哪个蛋白结合了抗体，那么这个蛋白就是X，与之对应的cDNA就是蛋白X的基因。
这是研究蛋白纯化和所对应基因的两个方面，实际上我们在进行蛋白纯化时需要考虑很多方面，书上很多都提到了，这里我只是摘取重要的来说，具体见书（我再赘述没有意义）：
1. 我需要多少蛋白：如果我们纯化蛋白质的目的不同，我们所需要纯化蛋白质的量和蛋白质的纯度也是不同的
2. 建立测定目标蛋白活性的方法：我们要选择灵敏方便的、高度专一的蛋白质测定方法
3. 选择适合的材料，一般就是选择高表达该蛋白的组织材料，如果没有高表达的，可以通过基因工程来对其进行高表达
蛋白质纯化注意事项：
一定注意蛋白质是不允许变性的，所以尽可能低温、少搅动、避免速冻、多次冻融，同时尽可能模拟蛋白质其原本的生理环境，维持适宜的pH，使用蛋白酶抑制剂，使用金属螯合剂，加入一定还原剂，加入一定灭菌溶液等等
蛋白质纯化的常见方法
分离纯化蛋白质的各种方法都是利用不同蛋白质以及蛋白质与其他物质之间在某一理化性质的差别进行的。
1. 沉淀和离心
沉淀是根据不同蛋白质在特定条件下溶解性不同，而对它们进行选择性沉降而达到分离目的的一种粗纯化方法。实现选择性沉降的常见方法是利用电性差异，如使用pI或者是盐析，但是在沉降之后，我们都需要采用离心的方法来分离。
颗粒在离心力下沉降的趋势可以用沉降系数SC来定量表征：SC=（p-m）*V/f，其中p是颗粒密度，m是颗粒所处介质密度，V是颗粒体积，f是摩擦系数（其中球形的摩擦系数最小）
那么一般来说生物大分子的沉降系数在（1~500）*10^(-13)s之间，也因此，我们人为规定10^(-13)s为一个S，那么此时我们应该想起来rRNA中是如何命名各个rRNA了，就是依据沉降系数的大小来进行分类的。
制备用离心机在应用方法上有两种形式，一种是沉降速率离心（在密度均一的介质中进行的离心），其中差速离心最为常见，这种离心是通过每次调整离心的速率来实现对不同密度颗粒的分离，常见的应用场景就是对于细胞器的分离；一种是梯度离心（在具有密度梯度的介质中进行的离心），又可以分为密度梯度离心和平衡密度梯度离心；
密度梯度离心是在不连续的密度梯度介质当中进行的沉降速率离心，常用蔗糖和甘油来制备梯度，比如我们可以构建三挡密度，然后不同密度的颗粒就会在离心作用下分布在不同的梯度溶液中。但是这个是和离心时间有关的，因为我们构建的梯度可能会在长时间的离心作用下溶质也发生转移，这样梯度构建就失效了（对于沉降速率离心也要注意这一点，本质上是控制离心速率和所需离心时间来分离颗粒的）
但是平衡密度梯度离心就不需要关注离心时间这个问题，因为平衡梯度离心构建的是连续的密度梯度，也就是溶质与颗粒一同离心，那么溶质会形成连续的密度梯度，颗粒如果到达相同的梯度便停止沉降，所以对于离心时间不影响颗粒的离心，但是要注意离心时间也不可以过长，否则溶质会不断沉降，导致颗粒之间差别变小，不易于提取。
总而言之，对于离心，理解沉降的机理然后梯度的构建方法，然后选择适当的离心方法、离心速率和离心时间来达到分离的目的。
2. 透析和超滤
透析实际上是利用了蛋白质颗粒大小的性质，利用其不可以通过半透膜而小分子物质可以透过，来实现对蛋白质分子的纯化，同时我们可以同时施加或减小压强来滤过，那么我们把这称之为超滤。如果我们在外界溶液中加入吸水性强的多聚物，我们可以实现对蛋白质分子的浓缩，这种方法称之为反透析。
3. 电泳
电泳是指带电的颗粒和分子在外加电场的作用下，向带相反电荷电极定向运动的现象，带电粒子的大小、形状以及带电情况都会影响到电泳速率。
电泳根据有无支持物可以分为有支持物的区带电泳和无支持物的自由电泳。“前者包括显微电泳和密度梯度电泳等。区带电泳则包括以滤纸作为支持物的纸电泳、以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳，以及以琼脂糖或聚丙烯酰胺等凝胶为支持物的凝胶电泳。”（这段直接抄书了嘻嘻）
那么我们接下来介绍三种常见蛋白质电泳方法：
1. IFE（等电聚焦电泳）
这种电泳方法是在凝胶中加入两性电解质，在两极之间建立pH梯度，那么在电场作用之下，不同等电点的蛋白质就会移动到相应的pH下，在这个环境下蛋白质颗粒就不带电荷，也就因此停止移动。那么根据这个原理，我们可以很轻松地想出，在正极是pH低的，在负极是pH高的（可以这么想，如果一个蛋白质的等电点是酸性，但是现在这个蛋白质是在中性，也就是这个蛋白质现在会带负电，那么在电场作用下就会向正极移动，所以正极就是pH更低的一极）
2. SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）
这种电泳方式的关键是引入了去垢剂的作用SDS，在SDS的作用下，蛋白质会带上大量负电荷，所以蛋白质本身的电性就可以忽略，同时SDS可以破坏蛋白质的三级结构，使得蛋白质呈现线状，所以形状因素也可以消除，所以SDS-PAGE的电泳方法最后得到的结果就是蛋白质的分子量影响的电泳速率的不同。
但是也需要注意的是，SDS会使得亚基分离，所以如果想要知道具有四级结构的蛋白质的分子量是比较困难的（但是如果纯化之后，可以通过亚基的丰度之比和亚基大小基本推断出来）。同时SDS-PAGE还可以用来定位二硫键，我们可以先还原蛋白质破坏二硫键，然后根据SDS-PAGE电泳结果就可以知道二硫键是如何形成的了（这个可以用来分析在哪两个亚基之间形成了二硫键，更细致的分析需要酶解肽段，然后上质谱分析）
3. 双向凝胶电泳
双向凝胶电泳技术实际上是上述两种凝胶电泳技术的综合，对于等电聚焦电泳，可以通过电性来分离不同的蛋白质，对于SDS-PAGE是通过分子量来分离不同的蛋白质。
所以我们可以先使用等电聚焦来分离电性不同的蛋白，然后再通过SDS-PAGE来分离分子量不同的蛋白，这样我们就可以得到一个蛋白质的二维电泳图谱。
切记这两个电泳的方向不可以替换，因为SDS会直接附着在蛋白质上，蛋白质电性已经被均一化了，所以等电聚焦是得不到结果的。
4.层析
所有的层析系统都由两相组成，一个是固定相，可以是固体物质，也可以是固定在固体物质上的成分；另一个是由可以流动的物质组成的流动相，那么当样品随着流动相沿着固体相流动的时候，由于样品颗粒与固体相和流动相之间的作用不同，与固体相结合能力强的被吸附，与流动相作用更大的继续随流动相流动。最后我们可以得到固体相和流动相的不同组分物质，或者是固体相不同部位的不同组分物质，最后采用一定方法洗脱固体相上吸附的颗粒即可。
下面根据层析原理分为五种层析方法：
（1）离子交换层析：（电性）
离子交换层析是用含有带电基团的树脂作为固定相，然后利用树脂和流动相中带有相反电荷的离子吸附并且进行可逆交换（原本在树脂中相同电性的离子释放到流动相中）。那么如果想要吸附的是流动相中的阳离子，那么称作为阳离子交换层析，反之，称之为阴离子交换层析。那么首先在进行上样品之前，我们需要用几倍于柱体的低盐缓冲溶液对树脂进行平衡，一方面可以洗去树脂的杂质，一方面也可以使得树脂吸水，使得带电基团暴露，更有利于后面的离子交换。然后在低盐缓冲溶液下，将样品上柱，那么可以实现不同电性离子的分离，之后我们可以使用高盐缓冲溶液洗脱与树脂结合的物质（高浓度的离子更有利于被吸附）
（2）疏水作用层析（HIC）（疏水）
首先，首先需要将蛋白质溶液放置在高盐溶液中，以破坏蛋白质分子表面的水化层，使得蛋白质分子的疏水基团可以暴露在表面。那么在固体相中会连接在惰性基质上的疏水基团，那么当流动相流经的时候，一方面疏水蛋白质的表面亲水残基少，水化层更容易被破坏，另一方面，疏水残基也正好可以和疏水基团相互作用。但是由于是采用高盐溶液处理，所以可能对蛋白质的活性产生一定的影响。HIC的洗脱方法有，降低洗脱液的盐浓度（重新形成水化层），增加洗脱液的去垢剂浓度（竞争被吸附的蛋白质）或者改变pH（改变蛋白质的电性）
（3）亲和层析（电性）
亲和层析是利用可以特异性相互作用的两种物质（AB），如果我们要分离的样品中有其中一种物质（A），那么我们可以利用另外一种物质（B）共价结合到固体相的基质上，然后让样品（流动相）流经，那么样品中的该物质（A）就可以被吸附。那么我们可以用更高浓度的B来洗脱或者改变pH（那么这一对物质可以是酶和底物，可以是抗体与抗原（广义））
（4）聚焦层析（CF）（电性或者疏水）
这种层析方式是根据蛋白质的pI不同进行分离，整体的原理可以说是这五种中最为复杂的。
首先，会利用特定的缓冲液在层析柱形成连续的一定宽度的pH梯度，然后再上样品，和等电聚焦是一样的，当蛋白质移动到pH=pI的位置的时候（在电场作用下），那么此时不带电荷，蛋白质停留，那么当所有蛋白质都停留的时候，我们开始洗脱蛋白质。这里有两种方式洗脱，一种是采用不同pH的缓冲液，比如原本pI=5的蛋白质，当我采用pH=5.2的缓冲液的时候，此时蛋白质就会带上负电，脱离原有位点，在电场作用下分离体系，然后我们可以逐步升高pH来实现不同等电点蛋白质的洗脱。或者我们可以使用高盐溶液进行洗脱，这是最先被洗脱下来的是疏水性质更强的蛋白质（水化层更容易被破坏）
（5）凝胶过滤层析（分子量/大小）
此种层析是采用装有细而多孔的凝胶颗粒的层析柱，然后当流动相经过的时候，其中比较大的粒子由于可以运动的轨迹比较单一，所以较快就流出；比较小的颗粒可以进出凝胶颗粒内部，所以运动路径较长，由此大小不同的蛋白质得以分离，同时需要调整凝胶颗粒的大小来逐步分离大小不同的颗粒。
总结一下，蛋白质纯化可能不是一步就可以完成的工作，可能需要多种纯化手段接替使用，同时在每一次纯化之后检测蛋白质的活性和含量（测定比活性和总活性，比活性应当在每一次纯化后都有所提升，总活性可能会因为蛋白质含量的下降而有所下降，但是如果在某些情况下如去除了蛋白酶或者是抑制剂，总活性也有可能提升）。在我们最后完成蛋白质纯化之后，我们需要检测蛋白质的纯度，我们可以采用电泳法，看条带个数和宽度，可以采用化学分析，检测蛋白质是否具有恒定的N端和C端，也可以采用质谱分析或者HPLC（高效液相层析，原理和我们介绍的液相层析的原理是一致的，只是颗粒更细，流速更快，并且实现了自动化）
那么我们在进行纯度分析的时候，一定要注意用不同的方面对蛋白质进行分析，比如不要同时使用SDS-PAGE和凝胶过滤层析来对蛋白质纯度进行分析，因为这仅仅分析了一个大小的角度。
蛋白质大小的测定
一般有以下几个方法可以用来测定蛋白质的相对分子质量：
1. SDS-PAGE
这是实验室最常见测定蛋白质Mr的方法，由于蛋白质的相对分子质量的对数和电泳迁移率（m）之间成线性关系（lgMr=k-bm），所以我们可以用几种大小已知的蛋白质为标准进行电泳，作出标准曲线，然后根据我们未知蛋白的迁移率算出其相对分子质量
2. 凝胶过滤法
这个的思路和上面的思路是相近的，Mr的对数和洗脱体积之间成线性关系，所以我们仍然可以使用几种已知Mr的蛋白质为标准进行凝胶层析，得到标准曲线，然后再根据位未知蛋白的洗脱体积来算出其的相对分子质量
3. 超速离心法
蛋白质分子在离心机中的沉降速率和蛋白质颗粒大小成正比，所以我们可以应用光学方法测得蛋白质沉降速率，然后根据沉降速率计算沉降系数SC，将SC带入公式算得Mr
4. 质谱法
这里就不赘述了，物理和有机化学当中都有涉及原理，其实也是很准确的一种方式，就是需要有一定财力才可以实现罢了。
蛋白质pI的测定
可以再强调一次，蛋白质的pI不仅和一级结构有关，也与三级结构有关，所以pI的准确测定是需要实验的。
蛋白质在机体内表达的分析
蛋白质在机体的表达情况常用Western印迹的方法来测定。Western印迹的主要思路就是利用抗原抗体杂交的特异性，同时将抗体偶联酶，使得蛋白分布部位可以发出有色标记或者抗体直接偶联荧光基团，直接发生荧光。
那么具体步骤如下，首先我们需要或者特定蛋白X的抗体（这里称为一抗）（如果我们采用免疫模式动物小鼠产生一抗），那么我们接着用小鼠的二抗偶联酶（可以催化无色底物变为有色底物），结合一抗，由于一抗有不变序列区，所以二抗靶点就是不变序列（这也是为什么去用二抗的原因，如果我们直接一抗偶联酶，原理上是可行的，但是每一次我们都得去做偶联反应，但是如果我们采用二抗的方式就可以批量生产了）。那么最后在蛋白质表达的位点都有酶的间接附着，我们只需要用无色底物浸润，酶会催化底物变为有色，从而标记蛋白质在哪里表达。或者更简单的是直接偶联荧光基团，那么最后洗去没有结合的二抗，就可以根据保留的荧光标记来得到蛋白质表达位点。
蛋白质一级结构的测定
蛋白质一级结构的测定是研究其他层次的结构和蛋白质功能的基础，蛋白质一级结构的测定可以分为直接测定法和间接测定法。
（1）间接测定法
间接测定法实际上是利用了基因和蛋白质氨基酸序列的对应关系实现的，那么对于原核生物，直接找出可读框，根据遗传密码反推出氨基酸序列，对于真核生物后一步是一样的，但是不可以直接从基因入手（因为包含内含子），一般从cDNA反推氨基酸序列。这个方法比较简单，我们不需要逐层纯化蛋白质然后测定，但是问题在于我们得到的信息是有限的，我们不知道蛋白质在加工过程中是如何剪切的，哪些肽段丢弃了，二硫键是如何形成的。
（2）直接测定法（分为9步）
见书，现在的方法可能已经革新，所以感兴趣的可以对照课本学习。