全长抗体表达:从载体策略到产业化,如何实现高活性抗体的高效生产?
全长抗体因保留完整抗原结合能力与 Fc 段介导的效应功能(ADCC、CDC),且具有更长的体内半衰期,成为抗体药物的主流形式 —— 截至 2016 年底,FDA 批准的 63 个抗体药物中 54 个为全长抗体。由于全长抗体需实现轻链(LC)与重链(HC)的正确折叠、组装与分泌,其表达高度依赖哺乳动物细胞系统,而载体构建策略则是决定抗体表达量、组装效率与产业化可行性的核心环节。从单顺反子到基因编辑优化,不同载体策略的选择与迭代,直接推动全长抗体生产从 “实验室研发” 走向 “大规模产业化”。
一、全长抗体表达的核心价值:为何必须依赖哺乳动物细胞?
全长抗体的独特优势源于其完整结构:可变区(V 区)负责特异性结合抗原,阻断靶分子信号通路;恒定区(Fc 段)则通过结合 FcγR 介导 ADCC 效应(激活免疫细胞杀伤靶细胞)、结合补体 C1q 介导 CDC 效应(触发补体系统裂解靶细胞),同时 Fc 段与新生儿 Fc 受体(FcRn)结合,显著延长抗体体内半衰期(通常达 14-21 天),减少给药频率。
这种复杂功能对表达系统提出严苛要求:需正确完成二硫键形成、糖基化修饰(如 Fc 段的 N - 糖基化直接影响 ADCC 活性)等翻译后加工,而哺乳动物细胞(如 CHO 细胞、HEK293 细胞)是唯一能精准模拟人源蛋白修饰的系统 —— 原核细胞无法完成复杂糖基化,昆虫细胞修饰模式与人类差异大,均可能导致抗体免疫原性升高或效应功能丧失。因此,目前全球所有上市全长抗体均由哺乳动物细胞表达,其中 CHO 细胞因表达稳定、可大规模悬浮培养,占据 80% 以上的产业化市场。
二、四大载体构建策略:适配不同研发与生产需求
全长抗体表达的核心挑战是 “实现 LC 与 HC 的高表达、比例匹配与正确组装”,不同载体策略通过优化基因调控元件与筛选机制,形成适配不同场景的解决方案:
1. 单顺反子载体:产业化最成熟的 “经典方案”
单顺反子载体将 LC 与 HC 基因分别构建在两个独立载体中,共转染宿主细胞,通过独立启动子(如 CMV、EF-1α)调控各自表达。其优势在于 “表达比例可控”—— 可通过调整两个载体的转染比例(通常 1:1 至 1:2),确保 LC 与 HC 摩尔比接近 1:1,减少游离链积累,提升组装效率。
以阿达木单抗(全球销售额最高的抗体药物)为例,其采用双质粒单顺反子系统:LC 载体与 HC 载体分别携带 EF-1α 强启动子,共转染 CHO 细胞后,通过 MTX(甲氨蝶呤)加压筛选高表达克隆,最终实现 5-10 g/L 的分泌型表达。该策略的核心优势是技术成熟、批间稳定性高,适配大规模商业化生产,目前 70% 以上的上市全长抗体采用此方案。
2. 双顺反子载体:提升转染效率的 “简化方案”
双顺反子载体在单一载体中串联 LC 与 HC 基因,通过核糖体内部进入位点(IRES)或自切割 2A 肽(如 T2A、P2A)实现 “单载体共表达”。IRES 策略中,LC 由强启动子驱动(如 CMV),HC 依赖 IRES 介导的翻译起始(效率约为前者的 50%-70%);2A 肽策略则通过 “翻译后自切割”,使 LC 与 HC 在同一阅读框架下表达,切割效率可达 90% 以上,更易实现比例匹配。
早期利妥昔单抗研发中曾尝试 IRES 双顺反子载体,但因 HC 表达不足导致组装效率低,最终改用单顺反子系统;而近年 2A 肽技术的突破(如优化 T2A 序列减少残留氨基酸),使双顺反子载体在早期研发中应用增加 —— 例如某团队将抗 PD-1 抗体的 LC 与 HC 通过 T2A 串联,转染 HEK293 细胞后,抗体表达量较 IRES 系统提升 30%,且组装率达 95% 以上,大幅缩短早期筛选周期。
3. 反式互补载体:高特异性筛选的 “精准方案”
反式互补载体的核心创新是 “筛选标记互补”:两个载体分别携带二氢叶酸还原酶(DHFR)的 N 端与 C 端片段,仅当 LC 载体与 HC 载体同时转染 CHO-DG44 细胞(内源性 DHFR 缺陷)时,才能形成功能性 DHFR,在 MTX 加压下存活。这种 “双载体依赖筛选” 可显著提高阳性克隆比例,减少空载体或单载体转染细胞的干扰。
帕妥珠单抗(HER2 阳性乳腺癌治疗药物)采用该策略:LC 载体携带 DHFR N 端片段,HC 载体携带 C 端片段,共转染后通过逐步提高 MTX 浓度(0.1-1 μmol/L),筛选出抗体产量 3-5 g/L 的稳定细胞株。其优势在于筛选特异性高,适合难以获得高表达克隆的复杂抗体(如双抗的全长形式)。
4. 多顺反子单载体:追求 “等摩尔表达” 的 “集成方案”
多顺反子单载体在单一载体中串联 LC 与 HC 基因,且各自配备独立启动子与终止子(如 LC 由 CMV 驱动,HC 由 EF-1α 驱动),理论上可实现两者等摩尔表达。例如贝伐珠单抗早期研发中,曾构建此类载体,但因载体过大(约 15-20 kb)导致转染效率降低,且 LC 表达量偏低(约为 HC 的 80%),最终通过引入内源性 κ 轻链基因座增强子,使 LC 表达提升至 HC 的 95%,产量达 8 g/L。
该策略的核心价值是 “简化转染流程”—— 无需优化双载体比例,适合自动化高通量筛选,但需平衡载体大小与转染效率,目前更多应用于早期抗体分子筛选,而非大规模产业化。
三、基因编辑优化:推动表达量与稳定性再突破
传统载体策略依赖随机整合,抗体表达量与细胞株稳定性受整合位点影响大(即 “位置效应”)。近年 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的应用,实现了 “定点整合高表达位点”,显著提升全长抗体的表达水平与批间一致性。
以曲妥珠单抗为例,研究人员利用 CRISPR/Cas9 将其 LC 与 HC 基因定点整合至 CHO 细胞的 HPRT 位点(已验证的高表达 “热点”),通过同源定向修复(HDR)确保基因拷贝数均一(通常 1-2 个拷贝),最终抗体表达量较随机整合细胞株提升 2 倍(达 12 g/L),且连续培养 60 代后表达量无显著下降,解决了传统细胞株 “传代稳定性差” 的痛点。
此外,基因编辑还可通过 “敲除不利基因” 优化表达:例如敲除 CHO 细胞的 α-1,6 - 岩藻糖转移酶,使抗体 Fc 段去岩藻糖修饰,ADCC 效应提升 10-100 倍;敲除蛋白酶基因(如 C1s),减少抗体降解,提升产物纯度。
总结
全长抗体的表达是 “载体策略、细胞系统与基因调控” 的协同工程 —— 单顺反子载体适配产业化,双顺反子与多顺反子载体简化早期研发,反式互补载体提升筛选特异性,而基因编辑技术则推动表达量与质量再突破。未来,随着 AI 辅助载体设计(预测最优启动子与增强子组合)与合成生物学(构建 “定制化 CHO 细胞株”)的发展,全长抗体表达将向 “更高产、更稳定、更低成本” 方向迈进,为抗体药物的普惠化提供核心支撑。
泰克生物提供全长抗体表达全流程支持,助力高活性抗体药物研发与产业化。