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环状肽药物发现新路径：DNA 编码文库技术（DELT）的突破与挑战

news 2025/9/8 7:25:59

在多肽治疗领域，环状肽因兼具高靶点特异性与较好代谢稳定性，已成为口服药物、肽 - 药物偶联物（PDC）、诊断探针等方向的研究热点。然而，高效筛选出具有临床潜力的环状肽候选分子，始终是制约该领域发展的核心瓶颈。本文将系统梳理环状肽筛选技术的迭代历程，重点解析 DNA 编码文库技术（DELT）在环状肽发现中的独特优势、技术进展及数据解析难题。

一、环状肽筛选技术的 “三代迭代”：从天然提取到基因编码展示

早期环状肽药物研发高度依赖 “天然产物提取”—— 临床获批的多肽药物多源自天然肽或其衍生物。但这种方式受限于天然资源，难以满足制药行业对新靶点、新结构分子的需求，推动研究者转向技术创新，形成两类主流筛选技术：

1. 基因编码展示技术：快速筛选但受限于天然氨基酸

噬菌体展示、mRNA 展示等基因编码技术，凭借 “基因型 - 表型偶联” 特性，可快速构建海量多肽文库（含 10^8-10^12 个序列）并针对靶点筛选。例如：

噬菌体展示：通过改造噬菌体表面蛋白，将随机多肽文库展示于噬菌体表面，经多轮亲和筛选富集高亲和力候选肽；
mRNA 展示：利用体外翻译系统，通过嘌呤霉素将新生肽与编码其的 mRNA 共价连接，实现 “序列 - 功能” 的精准对应。

这类技术已成功推动多款多肽进入临床（如 FDA 获批的肽类药物），但核心局限在于：传统方法仅能利用 20 种天然氨基酸，导致筛选出的多肽易被体内酶降解（代谢不稳定）、难以穿透细胞膜（生物利用度低）。

为突破这一局限，研究者将 “遗传密码扩展技术” 与噬菌体展示结合（引入非天然氨基酸），或在 mRNA 展示中使用 flexizyme 酶（实现非天然氨基酸掺入）。但这些改进技术复杂度极高，操作门槛高，难以在普通实验室推广。

2. DNA 编码文库技术（DELT）：兼顾多样性与可及性的新选择

化学合成文库虽可灵活引入非天然氨基酸、实现多种环化策略，但传统筛选需逐一验证化合物，效率极低。而DNA 编码文库技术（DELT） 通过 “DNA 条形码与合成分子偶联”，将海量化合物（可达 10^12 个）编码为可快速测序分析的文库，完美解决了 “多样性” 与 “筛选效率” 的矛盾：

优势 1：兼容性强 —— 可结合化学合成的灵活性，引入非天然氨基酸、设计刚性环状骨架，显著改善多肽的代谢稳定性与膜通透性；
优势 2：应用场景广 —— 早期 DELT 主要用于小分子药物发现（多款候选分子进入临床），后逐步拓展至环状肽筛选，成为基因编码展示技术的重要补充；
优势 3：技术门槛低 —— 无需复杂的基因工程操作，普通实验室通过标准化化学合成即可构建文库，更易普及。

二、DELT 在环状肽筛选中的技术突破：从 “模板合成” 到 “双展示平台”

DELT 应用于环状肽筛选的技术路线，经历了多轮优化，形成多种成熟方案：

1. 早期探索：DNA 模板合成（DTS）奠定基础

Liu 课题组开创的DNA 模板合成（DTS） 技术，首次证实 DELT 构建环状肽文库的可行性 —— 以 DNA 为模板，通过碱基互补配对引导反应物有序连接，实现环状肽的精准合成。基于这一技术，Liu 联合创立的 Ensemble Therapeutics 进一步推动了环状肽的产业化研发。

2. 主流方案：DNA 记录合成主导文库构建

随着技术发展，DNA 记录合成逐渐取代 DTS，成为环状肽 DELT 的主流方法：

2018 年，GSK 报道首个 DNA 记录环状肽文库 —— 通过 6 轮合成反应，构建出含 2.4×10^12 个独特编码化合物的文库，刷新了环状肽文库的规模纪录；
Neri/Scheuermann 课题组则开发 “预环化骨架偶联” 策略：先将预环化骨架连接到 DNA 标签上，再通过位点特异性化学修饰完成环化，提升了环状结构的多样性。

3. 技术创新：固相 DELT 与双展示平台

为解决 “水敏感反应兼容性”“功能筛选效率” 等问题，多个团队开发了固相 DELT 技术：

Paegel、Kodadek、Lim 等课题组通过优化固相载体与反应条件，使 DELT 可兼容水敏感化学反应，同时支持原位功能筛选；
近期，Scheuermann 团队进一步提出 “双展示 DNA 编码环状肽平台”—— 结合自组装技术与两步环化策略，同时开发 “双连接子固相合成法”，显著提升了文库质量与筛选准确性。

三、DELT 筛选环状肽的核心挑战：数据解析的 “独特难题”

2020 年后，环状肽治疗领域的热度推动 DELT 相关技术快速发展 —— 大量兼容 DELT 的环化方法、高活性环状肽候选分子被报道（如针对 MDM2、GIT1 的抑制剂）。但与技术进展形成反差的是，环状肽 DELT 的数据解析研究严重滞后：

1. 传统数据解析方法的局限性

小分子 DELT 的筛选分析通常基于 “特征富集频率统计”：通过计数富集序列的频率，绘制三维散点图，解析 “结构 - 富集关系”（如单个构建模块的贡献），再通过计算机模拟筛选潜在候选分子，最终脱 DNA 合成验证。此外，小分子 DELT 还发展出多种数据校正方法（如标准化 Z 分数、泊松分布归一化、“活性分数” 计算）及专用工具（如 DELdenoiser）。

但环状肽的特性使这些方法难以直接套用：

构象灵活性高：环状肽的构象易受环境影响，相同序列可能因构象差异表现出不同结合活性，单纯依赖 “序列频率” 易误判候选分子；
疏水性较强：环状肽的疏水区域可能与 DNA 标签发生非特异性相互作用，导致 “假阳性富集”，干扰真实结合信号的识别。

2. 案例实践：MDM2 与 GIT1 筛选的 “两种典型场景”

研究通过两个案例（针对 MDM2、GIT1 的环状肽筛选），揭示环状肽 DELT 数据解析的关键原则：

MDM2 筛选：MDM2 是 p53 的负调控因子，通过促进 p53 泛素化降解抑制其抑癌功能，是抗癌药物的经典靶点。由于其结构与生化数据丰富，常被用作筛选技术的验证模型。在 DELT 筛选中，多个子文库均出现相同的构建模块（BB）组合富集，这类 “跨文库重复富集” 可显著提升候选分子的可信度；
GIT1 筛选：GIT1 与 β-PIX 的相互作用与肿瘤进展、转移密切相关，但二者结合界面极浅，难以通过小分子调控，而环状肽是该靶点的理想调控工具。在筛选中，部分富集信号仅出现在单个子文库中，这类 “孤立富集” 需通过更严格的验证（如脱 DNA 合成后 SPR 结合实验、细胞活性检测）排除假阳性。

值得注意的是，本研究使用的 DNA 编码环状肽文库（DECPLs）包含 8 个子文库 —— 各子文库使用相同构建模块，但采用不同环化策略（如氧化二硫键形成、巯基 - 亲电试剂交联），这种 “同模块、不同环化” 的设计，可有效区分 “环化方式” 与 “序列” 对结合活性的贡献，为后续分子优化提供更精准的方向。