基于TurboID的邻近标记质谱（PL-MS）实验指南③：完整实验流程

引言

此前我们学习了TurboID融合表达系统的构建及稳转细胞系的建立，接下来我们继续学习。本系列我们以CRISPR/Cas9基因编辑技术、TurboID邻近标记方案为例，为研究生提供一套详细、可操作的实验流程。方案将涵盖从POI-TurboID融合表达系统的设计与构建，到稳转细胞系的建立与验证，再到邻近生物素化标记、细胞裂解、链霉亲和素富集以及样品制备用于质谱分析的全过程。通过遵循本方案，研究者有望高效、准确地鉴定其POI在生理条件下的互作蛋白，为深入理解其生物学功能和相关疾病机制提供关键线索。本方案基于编者文献查询及经验总结，不同课题的POI、细胞等条件不一，本文仅提供实验通用条件起步参考，实际课题应根据实验反馈做方法学优化调整。

核心实验：TurboID邻近标记、裂解与亲和富集

在获得并验证了稳定表达POI-TurboID融合蛋白的细胞系后，即可进行邻近生物素标记实验。此部分将详细阐述从生物素标记、细胞样品处理、生物素化蛋白质的链霉亲和素亲和富集到样品制备用于质谱分析的完整实验流程。

生物素标记

 (Proximity Labeling)

细胞准备

将验证合格的POI-TurboID稳转细胞系 (以及相应的对照细胞系，见下文) 培养至合适的汇合度 (通常为70-90%)。确保细胞状态良好。

建议设置至少三次生物学重复，以保证结果的统计学可靠性。

生物素孵育

●试剂：生物素 (Biotin, Vitamin H, CAS: 58-85-5)。通常将其溶于DMSO或PBS制成储存液 (如50-100 mM)，使用前用培养基稀释至工作浓度。建议使用新鲜配制或分装冻存的生物素溶液。

●浓度：向细胞培养基中加入外源生物素。对于TurboID，常用浓度范围为50 µM - 500 µM。具体最佳浓度可能因细胞类型、TurboID表达水平和POI特性而异，建议通过预实验进行优化。(Branon et al., Nat Biotechnol 2018 在HEK293T细胞中使用50 µM或500 µM；May et al., Cells 2020 在A549细胞中使用50 µM)

●标记时间: TurboID的显著优势在于其快速的标记动力学。典型的标记时间为10分钟 (Branon et al., Nat Biotechnol 2018; Cho et al., Nat Protoc 2020)。也可以进行时间梯度优化 (如5, 10, 15, 20分钟) 来确定最佳标记窗口。

●培养时间：在标准的细胞培养条件下 (37°C, 5% CO2) 进行生物素标记。

终止标记与淬灭

●标记时间结束后，迅速吸除含有生物素的培养基。

●立即用冰预冷的PBS (Phosphate Buffered Saline) 洗涤细胞2-3次，以彻底去除残留的未反应生物素并降低细胞代谢活性，从而终止标记反应。

●可选淬灭步骤: 为了更彻底地中和细胞表面或培养基中残留的活性生物素-AMP中间体，可以在最后一次PBS洗涤后，加入含淬灭剂 (如10 mM L-半胱氨酸、10 mM 抗坏血酸钠或10 mM Tris-HCl, pH 8.0) 的冰冷PBS，在冰上孵育5-10分钟。随后再次用冰冷PBS洗涤。

对照组设置（至关重要）

合理的对照组是区分POI特异性邻近蛋白与背景噪音的关键。以下是对照组的建议：

❶ 实验组 (POI-TurboID + Biotin): 表达POI-TurboID融合蛋白的细胞，加入生物素进行标记。

❷阴性对照1 (- Biotin Control): 表达POI-TurboID融合蛋白的细胞，但不加入外源生物素 (或加入等体积溶剂)。此对照用于评估TurboID酶的“泄露”活性 (即在无外源生物素时仍发生的低水平标记) 以及细胞内源性生物素化蛋白的水平。

❸阴性对照2 (TurboID-only Control / Location Control): 表达游离TurboID (如TurboID-GFP，或定位于与POI不同亚细胞区域的TurboID，例如，若POI为核蛋白，则对照可为胞浆定位的TurboID-NES) 的细胞，加入生物素进行标记。此对照有助于识别那些由于TurboID酶活性本身或因其高丰度而普遍标记的非特异性“旁观者 (bystander)”蛋白，以及特定细胞区室的背景蛋白。

❹阴性对照3 (Parental/Empty Vector Control): 未转染的亲本细胞或转染了空载体的细胞，加入生物素进行标记。此对照用于评估细胞固有的生物素化蛋白背景 (如天然存在的生物素依赖性羧化酶)。

细胞裂解

 (Cell Lysis)

裂解缓冲液 (Lysis Buffer) 配方与选择

●常用缓冲液: RIPA裂解液 (Radioimmunoprecipitation assay buffer) 因其含有较强的去污剂组合 (NP-40/Triton X-100, 脱氧胆酸钠, SDS)，裂解能力强，能有效溶解包括核蛋白和部分膜蛋白在内的大多数细胞蛋白，是PL实验中常用的裂解液。也可以根据POI的特性和互作的稳定性选择含较温和非离子去污剂 (如1% NP-40或Triton X-100) 的缓冲液。

●RIPA裂解液典型配方:

50 mM Tris-HCl, pH 7.4-8.0

150 mM NaCl

1% (v/v) NP-40 (或 Triton X-100)

0.5% (w/v) 脱氧胆酸钠 (Sodium deoxycholate)

0.1% (w/v) SDS (Sodium dodecyl sulfate)

加H2O至终体积

(STAR Protocols 提及RIPA用于洗涤磁珠，其组分也常用于裂解)。

●重要添加剂 (务必在裂解前新鲜加入)：

◆蛋白酶抑制剂复合物 (Protease inhibitor cocktail): 如Roche cOmplete™ Protease Inhibitor Cocktail，防止蛋白降解。

◆磷酸酶抑制剂复合物 (Phosphatase inhibitor cocktail): 如Roche PhosSTOP™，若研究磷酸化相关的互作则必须添加。

◆EDTA (1-5 mM): 螯合二价阳离子，抑制金属蛋白酶活性。

◆DTT (1-5 mM) 或 β-巯基乙醇 (β-ME): 还原剂，用于维持还原环境，但注意若后续有烷基化步骤，需考虑其影响或在烷基化前去除。

(Cho et al., Nat Protoc 2020 和 Branon et al., Nat Biotechnol 2018 均提及了蛋白组学样品制备中的细胞裂解步骤)。

裂解步骤

❶收集细胞：对于贴壁细胞，用细胞刮刀刮下或胰酶消化后收集细胞沉淀；对于悬浮细胞，直接离心收集。用冰冷PBS洗涤细胞沉淀1-2次。

❷加入足量冰预冷的裂解缓冲液 (含新鲜添加的抑制剂) 于细胞沉淀中。用量需根据细胞量调整，确保充分裂解。

❸在冰上孵育15-30分钟，期间可间歇性涡旋振荡或用移液器轻柔吹打以辅助裂解。

❹超声处理 (可选但常用于PL): 为了确保基因组DNA断裂 (降低粘度) 和核蛋白的释放，通常需要进行超声处理。使用探头式超声仪，在冰浴条件下进行短暂超声 (如输出功率20-40%，超声3-5秒，间歇10-15秒，重复数次)。超声参数需根据细胞类型和仪器进行优化，避免过度加热导致蛋白变性。

❺离心: 在4°C条件下，以较高转速 (如14,000-16,000 x g) 离心15-20分钟，以去除细胞碎片和未裂解的细胞核。

❻收集上清液，即为细胞总裂解液 (total cell lysate)。

❼蛋白定量: 取少量上清液，使用BCA法或Bradford法测定蛋白浓度。确保各样品间起始蛋白量一致，以便后续比较。

❽Western Blot验证(可选但推荐): 取少量裂解液 (约20-50 µg蛋白) 进行SDS-PAGE和Western Blot分析。

◆用链霉亲和素-HRP (Streptavidin-HRP) 检测整体生物素化水平，比较实验组与各对照组的差异。实验组应有明显的生物素化条带，而“- Biotin”对照组信号应显著减弱。

◆用抗POI或抗标签抗体检测POI-TurboID融合蛋白的表达情况，确保其在各相关样品中稳定表达。

生物素化蛋白的亲和富集

 (Affinity Purification)

亲和基质

常用链霉亲和素 (Streptavidin) 偶联的琼脂糖珠 (Agarose Resin) 或磁珠 (Magnetic Beads)。磁珠因其操作便捷、洗涤效率高、背景低等优点，在PL-MS实验中更为常用。

●例如: Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1 (Thermo Fisher Scientific, Cat# 65002) 或 Pierce™ Streptavidin Magnetic Beads (Thermo Fisher Scientific, Cat# 88817)。

磁珠/树脂预处理

❶根据样品量和蛋白浓度计算所需磁珠/树脂的量 (参考产品说明书)。

❷用移液器吸取所需体积的磁珠/树脂悬液至新的离心管中。

❸置于磁力架上使磁珠吸附于管壁 (或低速离心使树脂沉降)，弃去上清液。

❹加入适量裂解缓冲液 (不含SDS，或低浓度SDS，具体根据说明书) 或洗涤缓冲液重悬磁珠/树脂，轻柔混匀。

❺再次分离磁珠/树脂，弃去上清。重复洗涤2-3次，以去除储存液中的防腐剂并用实验缓冲液平衡磁珠/树脂。 (STAR Protocols 描述了磁珠清洗步骤)。

孵育

❶将等量的蛋白裂解液 (通常1-5 mg总蛋白，根据POI丰度和互作强度调整) 加入到预处理好的链霉亲和素磁珠/树脂中。确保所有样品起始蛋白量一致。

❷在4°C条件下，于旋转混合仪上缓慢旋转或摇晃孵育1-4小时，或过夜 (通常过夜孵育结合更充分)。孵育时间需优化。

严格洗涤 (Washing) 

——此步骤对降低背景至关重要

孵育结束后，必须通过一系列严格的洗涤步骤去除大量与链霉亲和素或磁珠非特异性结合的蛋白质，这是获得高质量质谱数据的关键。

洗涤策略

采用一系列不同严谨程度 (如不同盐浓度、不同去污剂类型和浓度) 的洗涤缓冲液，逐步去除背景蛋白。

洗涤缓冲液序列示例 (需根据实验体系优化)

❶裂解缓冲液洗涤 (不含或低SDS): 2-3次。用与孵育时相似的裂解缓冲液 (可去除SDS或降低其浓度，以减少对链霉亲和素-生物素结合的干扰) 洗涤，去除大部分未结合的蛋白

❷高盐缓冲液洗涤: 1-2次。例如，含500 mM - 1 M NaCl的缓冲液 (其他组分如Tris-HCl, 去污剂可保留)，用于去除通过离子相互作用非特异性结合的蛋白。

❸去污剂缓冲液洗涤: 1-2次。例如，含较高浓度非离子去污剂 (如1% Triton X-100或NP-40) 或不同类型去污剂的缓冲液。

❹尿素洗涤 (可选，非常严谨): 1次。例如，含1-2 M尿素的缓冲液 (通常在Tris-HCl, pH 8.0中)，用于破坏氢键和疏水相互作用，去除顽固的非特异性结合蛋白。洗涤后需用不含尿素的缓冲液彻底洗去残留尿素。

❺碳酸氢铵缓冲液洗涤 (用于后续酶切): 最后用不含去污剂和高盐的缓冲液 (如50 mM 碳酸氢铵, pH 8.0-8.5，或PBS) 洗涤2-3次，以去除残留的盐和去污剂，为后续的胰蛋白酶酶切创造合适的缓冲环境。

操作

每次洗涤时，加入1 mL左右的相应洗涤缓冲液，轻柔重悬磁珠/树脂，在室温或4°C条件下旋转孵育5-10分钟。然后通过磁力架分离磁珠 (或低速离心分离树脂)，小心吸弃上清液，避免吸走磁珠/树脂。 (Cho et al., Nat Protoc 2020 强调了蛋白组学样品制备中洗涤的重要性)。

洗脱生物素化蛋白或珠上酶切

 (Elution or On-Bead Digestion)

对于后续的LC-MS/MS分析，通常采用珠上酶切的方法直接将结合在磁珠/树脂上的生物素化蛋白消化成肽段。洗脱整个蛋白的方法较少用于质谱，更多用于Western Blot验证。

洗脱 (Elution) – 主要用于WB验证，较少用于质谱

●竞争性洗脱: 用含高浓度游离生物素 (如2-10 mM Biotin in PBS, pH 7.2-7.4) 的缓冲液，在37°C或室温孵育洗脱。缺点是洗脱效率可能不高，且引入的大量生物素可能干扰后续分析或质谱检测。

●变性洗脱: 用含SDS的缓冲液 (如1x或2x Laemmli sample buffer，含β-ME或DTT) 在95-100°C加热5-10分钟洗脱。此方法适用于后续的SDS-PAGE和Western Blot验证富集效果，但不适用于需要保持蛋白天然构象或进行常规质谱分析的样品 (因SDS不兼容质谱)。

珠上酶切 (On-Bead Digestion) – 质谱分析的首选方法

❶缓冲液准备: 将经过充分洗涤、带有生物素化蛋白的磁珠/树脂重悬于适合酶切的缓冲液中 (如50-100 mM 碳酸氢铵, pH 8.0-8.5; 或含少量变性剂如0.05-0.1% RapiGest SF™ (Waters) 或0.1% PPS Silent® Surfactant (Expedeon) 以提高酶切效率，这些变性剂后续需降解或去除)。体积通常为50-200 µL。

❷还原与烷基化 (推荐步骤，以确保酶切完全)：

◆还原: 加入DTT (Dithiothreitol) 至终浓度5-10 mM，在56-60°C水浴孵育30-60分钟，以还原蛋白质内的二硫键。

◆烷基化: 待样品冷却至室温后，加入IAA (Iodoacetamide) 至终浓度15-20 mM (DTT与IAA摩尔比约1:2至1:3)，在室温避光条件下孵育30分钟，以烷基化半胱氨酸残基上的巯基，防止二硫键重新形成。之后可加入少量DTT或半胱氨酸淬灭未反应的IAA。

❸ 酶切：

◆加入胰蛋白酶 (Trypsin, sequencing grade modified, 如Promega V5111)。酶与预估底物蛋白的质量比通常为1:20至1:50。由于珠上蛋白量未知，可按每样品加入0.5-1 µg胰蛋白酶。

◆在37°C条件下，于振荡孵育箱中轻柔振荡孵育4小时至过夜 (通常16-18小时)。

(Branon et al., Nat Biotechnol 2018 提及了on-bead digestion)。

❹ 终止酶切与肽段收集：

◆酶切结束后，加入甲酸 (Formic Acid, FA) 或三氟乙酸 (Trifluoroacetic Acid, TFA) 至终浓度0.5-1% (v/v)，以酸化样品，终止胰蛋白酶活性，并有助于肽段溶解。

◆将样品置于磁力架上使磁珠吸附，小心吸取上清液 (此即包含肽段的溶液) 至新的洁净离心管中。

◆可用少量酸化缓冲液 (如0.1% FA in 50% Acetonitrile/H2O) 再次洗涤磁珠一次，合并上清液，以最大限度回收肽段。

肽段纯化/脱盐

酶切后收集的肽段样品中通常含有盐分、少量去污剂残留和未完全酶切的大分子。这些杂质会干扰后续的LC-MS/MS分析。因此，必须进行肽段纯化和脱盐。

◆常用方法是使用C18固相萃取 (Solid Phase Extraction, SPE)。例如，自制的C18 StageTips (Empore™ C18 SPE Disks) 或商业化的C18 Sep-Pak® Cartridges (Waters)。

◆简要步骤：活化C18柱 (甲醇/乙腈 -> 酸化水溶液) -> 上样 (酸化肽段样品) -> 清洗 (酸化水溶液去除盐分) -> 洗脱 (高浓度有机相如50-80%乙腈含0.1% FA洗脱肽段)。

◆洗脱下来的肽段样品可以真空离心干燥 (SpeedVac)，然后在进行LC-MS/MS分析前用合适的缓冲液 (如0.1% FA in H2O) 复溶。

注意：质谱样品制备

质谱样品制备的每一步都需格外小心，避免角蛋白等常见污染。使用低蛋白吸附的离心管和枪头，并确保所有试剂均为质谱级别或超纯级别。

小结

本章我学习了TurboID生物素标记实验、细胞裂解及亲和富集实验、以及质谱前处理实验等，希望对你们也有帮助。本文属于PL-MS完整实验指南的一部分，由于篇幅过长，我打算分多篇文章发布，接下来我将整理PL-MS实验中的实验难点及常见解决办法，至此以TurboID为例的PL-MS的完整实验指南的学习整理就告一段落了。接下来我可能会分享IP-MS、strep pull down等实验的指南，或者标记酶的选择策略、亲和富集实验的选择策略等等实验笔记，欢迎持续关注！