Sigma-Aldrich细胞培养实验方案 | 悬浮细胞系的传代培养
目标
一般而言，源自血液的细胞系（例如淋巴细胞）在悬浮培养物中生长。细胞可以单细胞或成团生长（例如，EBV转化的淋巴母细胞系）。对于这些类型的细胞系，通过稀释进行继代培养相对容易。但是，对于成团生长的细胞系，可能需要通过离心将细胞置于单个细胞悬液中，并在计数前通过移液以较小的体积重新悬浮。
材料
- 细胞培养基 — 预热到适当的温度（有关正确的培养基和温度，请参阅ECACC细胞系数据表）
- 70％ (v/v) 乙醇无菌水溶液(Sigma-Aldrich 793213）
- 台盼蓝溶液 (Sigma-Aldrich T8154）
Sigma-Aldrich 产品说明（T8154）
台盼蓝是一种用于区分活细胞和死细胞的染料。它是一种不会被健康的活细胞所吸收但会对细胞膜受损的细胞进行染色的重要染料。这样，仅有死细胞会被计数。这种方法有时也被称为染料排除方法。
相同产品，但是规格为方便使用的冻干粉末形式，请见T6146
台盼蓝(TB)是一种阴离子亲水性偶氮染料，仅能穿过死细胞的细胞膜，因此可将死组织/细胞染成蓝色。用于通过拒染法显微计数，区分活的和死的哺乳动物细胞。
应用
台盼蓝溶液已用于：
- 细胞活力检测，计数活细胞和死细胞
- 在rescue实验中计数活细胞
- 台盼蓝拒染计数法，测定增殖曲线
- 配制生理盐水对照和脂多糖(LPS)溶液，确认LPS成功输注
- 台盼蓝拒染实验，测定胃上皮细胞(GEC)活力
- 通过血球计数板计数GEC细胞
制备说明
在 0.81% 氯化钠 和 0.06% 磷酸氢二钾中配制
设备
- 个人防护装备（无菌手套、实验室外套、护目镜）
- 设置到适当温度的水浴
- 适当密封水平的生物安全柜
- 培养箱
- 预先标记的培养瓶
- 倒置相差显微镜
- 离心机
- 类似Millipore Scepter™细胞计数器的血细胞计数板或自动细胞计数器。
- 马克笔
- 移液管
- 安瓿瓶架
- 纸巾
操作流程
- 使用倒置相差显微镜观察培养物。处于指数生长期的细胞应表现为明亮、圆形和有折光性。杂交瘤可能非常粘，需要轻轻敲击培养瓶以分离细胞。EBV转化的细胞会以十分难以计数的非常大的团块形式生长，并且大团块的中心可能细胞无法存活。
- 从细胞悬液中取出少量细胞样本（100-200μL）并对细胞进行计数。计算细胞/mL，将所需数量的细胞重新稀释到刚准备好的培养瓶中，无需离心，只需将细胞稀释即可。有关推荐的接种密度，请参阅细胞系随附的数据表。
- 每2-3天重复一次。
要点
- 如果细胞系是杂交瘤或其他能够产生感兴趣物质（例如重组蛋白或生长因子）的细胞系，请保留用过的培养基进行分析。
- 如果需要浓缩细胞，则以150xg离心5分钟，然后重悬至合适的体积，然后转移至培养皿中。
图 1.悬浮细胞系举例。冷冻/融化后24小时（A）和72小时（B）的Jurkat E6.1细胞显示出典型的悬浮淋巴细胞形态。当细胞融合率达到80%时，应仔细监测和传代。