小麦高分子量谷蛋白（HMW-GS）完整提取流程
下面给出一份“小麦高分子量谷蛋白（HMW-GS）”完整提取流程，包含实验室最常用的 提取液 A、B、C 以及 上样缓冲液 D 的配方与操作细节，可直接用于 SDS-PAGE 亚基分析。方法综合自 2024-2025 年发表并验证的文献 。
一、提取液配方（以 100 mL 为例，现配现用）
| 提取液 | 组成及终浓度 | 配制要点 |
|---|---|---|
| A | 50 % 异丙醇 0.08 M Tris-HCl pH 8.0 | 50 mL 异丙醇 + 8 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0 + 42 mL 水 |
| B | 50 % 异丙醇 0.08 M Tris-HCl pH 8.0 1 % DTT（w/v，现加） | 同 A 配方，临用前加入 1 g DTT 粉末 |
| C | 50 % 异丙醇 0.08 M Tris-HCl pH 8.0 1.4 % 4-乙烯基吡啶（v/v，现加） | 同 A 配方，临用前加入 1.4 mL 4-VP |
| D（上样缓冲液） | 0.625 M Tris-HCl pH 6.8 2 % SDS 20 % 甘油 5 % β-巯基乙醇 0.2 % 溴酚蓝 | 7.8 mL 1 M Tris-HCl pH 6.8 2 g SDS 20 mL 甘油 5 mL β-巯基乙醇 0.2 g 溴酚蓝 水定容至 100 mL，4 ℃避光保存 |
二、提取步骤（单粒法，2 mL 离心管）
-
磨粉
单粒小麦种子研磨成细粉，称取 0.10 g 置于 2 mL 离心管。 -
去醇溶蛋白（两次）
加入 1.5 mL 50 % 正丙醇，65 ℃水浴 30 min，期间每 10 min 振荡一次；
13 000 rpm 离心 5 min，弃上清；重复一遍。 -
还原提取（提取液 B）
沉淀加入 250 µL 提取液 B（含 DTT），65 ℃ 30 min，间断振荡。 -
烷基化（提取液 C）
再加入 250 µL 提取液 C（含 4-VP），65 ℃ 30 min，间断振荡；
13 000 rpm 离心 5 min，吸上清（≈400 µL）至新管。 -
上样前处理
取 200 µL 上清 + 200 µL 提取液 D，混匀后室温静置 30 min；
沸水浴 5 min 变性，速冷后 10 000 rpm 离心 1 min；
上清即为含 HMW-GS 的样品，可直接 SDS-PAGE 上样（推荐上样量 8–12 µL）。
三、电泳参数参考
- 凝胶：分离胶 8 %，浓缩胶 4 %，厚度 1 mm
- 电泳：恒流 15 mA/板，约 16 h（或 25 mA/板，4–5 h）
- 染色：0.05 % 考马斯亮蓝 R-250，24 h；蒸馏水脱色至背景清晰 。
四、注意事项
- DTT、4-VP 均 现用现加，避免氧化失效。
- 所有步骤 65 ℃ 为关键温度，切勿超过 70 ℃以防蛋白过度降解。
- 若只需 HMW-GS，可省略第 4 步（烷基化），直接用提取液 B 上样；但完整亚基图谱建议保留烷基化，以减少电泳条带拖尾 。
- 提取液 D 可批量配制，4 ℃避光保存 1 个月；使用前补加 β-巯基乙醇。