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单细胞转录组测序上游——cellranger

news 2025/10/30 10:48:48

1. 下载cellranger软件、sraToolkit软件并解压缩

#安装sraToolKit，用于下载sra数据
wget https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit#安装cellranger
wget https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest#解压完即可使用，但需要添加到环境变量
tar -zxvf [tar包] [指定路径可选]  解压压缩包（到指定路径）

2. 下载参考基因组

wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
#wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz
#mouse参考基因组数据集下载md5sum refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
tar -zxvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz

3. 设置路径

echo 'export PATH=/data/software/cellranger-7.1.0/bin/:$PATH' >> ~/.bashrc
echo 'export PATH=/data/software/sratoolkit.3.0.0-centos_linux64/bin/:$PATH' >> ~/.bashrc
source  ~/.bashrccellranger
#显示配置成功（每次登陆都要source）

4. 下载sra文件（GEO网站找）

（1）prefetch SRR8478397 –-max-size 100GB –progress
（2）解压缩
（3）生成fastq文件：fastq-dump –-split-files ./ SRR8478397/ SRR8478397.sra
（4）压缩（cellranger输入文件为压缩文件，并且上一步运行完非常占空间）：
gzip SRR8478397_1.fastq（单线程）
pigz SRR8478397_1.fastq（多线程，需下载pigz）

5. 改为cellranger要求的命名规范

[Sample Name]_S1_L00[Lane Number] _[Read Type]_001.fastq.gz

mv SRR8478397_1.fastq.gz GSM3576396_S1_L001_R1_001.fastq.gz
mv SRR8478397_2.fastq.gz GSM3576396_S1_L001_R2_001.fastq.gz

6. 运行cellranger

cellranger count --id=pbmc4k \
--transcriptome= /data/scRNAseq/00_cellranger/refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0 \
--fastqs=/data/scRNAseq/00_cellranger/pbmc4k/fastqs \
--IocaIcores=10 \
--localmem=30 \ --nosecondary \
--chemistry=auto&

参数解读

--id 指定输出文件的目录名；
--transcriptome 指定参考基因组路径
--fastqs指定存储测序文件的文件夹
--sample 指定需要处理的fastq文件的前缀
--expect-cell 指定预期的细胞数目，默认参数是3000个
--localcores 指定计算的核心数
--mempercore 指定内存大小 GB
--nosecondary 不需要进行降维聚类（后期用R可视化）

跑出来的pbmc4k文件夹里面的cmdline文件与out文件夹很重要，其他文件没用，特别是SC_RNA_COUNTER_CS文件夹删掉。

outs文件夹里的两文件夹（raw_feature_bc_matrix和droplet去除后的filtered_features_bc_matrix）是后续分析的文件。

结果解读

web_summary.html：必看，官方说明 summary HTML file ，包括许多QC指标，预估细胞数，比对率等；
metrics_summary.csv：CSV格式数据摘要，可以不看；
possorted_genome_bam.bam：比对文件，用于可视化比对的reads和重新创建FASTQ文件，可以不看；
possorted_genome_bam.bam.bai：索引文件；
filtered_gene_bc_matrices：是重要的一个目录，下面又包含了 barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz、matrix.mtx.gz，是下游Seurat、Scater、Monocle等分析的输入文件；
filtered_feature_bc_matrix.h5：过滤掉的barcode信息HDF5 format，可以不看；
raw_feature_bc_matrix：原始barcode信息，未过滤的可以用于构建矩阵的文件，可以不看；
raw_feature_bc_matrix.h5：原始barcode信息HDF5 format，可以不看；
analysis：数据分析目录，下面又包含聚类clustering（有graph-based & k-means）、差异分析diffexp、主成分线性降维分析pca、非线性降维tsne。Cellranger分析后一般自行进行Seurat分析，不用看；
molecule_info.h5：可用于整合多样本，使用cellranger aggr函数；
cloupe.cloupe：官方可视化工具Loupe Cell Browser 输入文件，无代码分析的情况下使用，会代码的同学通常用不到。