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RNA甲基化技术如何选择？

news 2025/9/27 9:19:02

在表观遗传学研究中，DNA甲基化和RNA甲基化是两类关键的修饰类型，它们在基因表达调控、细胞分化、疾病发生等过程中发挥重要作用。然而，由于DNA和RNA的化学性质差异显著，且甲基化位点分布、功能机制各不相同，研究者需要根据具体的研究背景（如样本类型、目标修饰类型、经费预算、技术可行性等）选择合适的技术方案。上期我们已经介绍了DNA甲基化研究技术如何选择，本期将聚焦RNA甲基化技术。

RNA甲基化以N6-甲基腺苷（m⁶A）为主（占真核生物mRNA甲基化的80%以上），此外还有m⁵C、m¹A等修饰类型。m⁶A主要分布在mRNA的编码区外显子、3'非翻译区（3'UTR）及长链非编码RNA（lncRNA）中，参与调控mRNA的剪接、出核、翻译效率及稳定性（如METTL3/METTL14复合物负责甲基化写入，FTO/ALKBH5负责擦除，YTHDF1/2/3等蛋白介导识别）。根据研究目标，RNA甲基化技术同样可分为三类。

RNA甲基化类型

第一类

整体定量

适用于快速评估样本整体甲基化状态，但无法提供位点特异性信息。

1. RNA甲基化Dot Blot

原理：将变性后的总RNA直接点在尼龙膜上，经UV交联固定后，用抗m⁶A（或m⁵C等）抗体孵育，化学发光显色，信号强度即代表甲基化水平。

分辨率：只能给出整体甲基化水平，无法定位具体位点。
适用场景：快速比较不同样本/处理组的全局m⁶A变化；高通量测序（MeRIP-seq等）前的预实验；低预算。
优点：操作简单、成本低；可平行检测多份样本；无需复杂仪器。
缺点：半定量；抗体交叉反应可致假阳性；无法提供序列定位信息。

Dot Blot结果

2. RNA LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）

原理：RNA酶解成单核苷→LC分离→串联质谱定量m⁶A、Am、m⁵C等修饰核苷与对应未修饰核苷之比。
分辨率：单碱基水平（可区分修饰类型），但无序列位置信息。
适用场景：绝对定量样本整体m⁶A、m⁵C等含量；验证高通量测序结果。
优点：灵敏度高、线性范围宽、重现性好；一次上机可同时检测多种修饰。
缺点：需昂贵LC-MS/MS系统与标准品；无法知道修饰发生在哪些转录本或位点。

LC-MS/MS原理

第二类

位点鉴定

适用于全面解析甲基化图谱，包括机制探索、生物标志物发现等。

3. MeRIP-seq(m6A-IP-seq)

原理：将总RNA随机打断→用抗m⁶A抗体免疫沉淀富集甲基化片段→建库测序→与input对照比对，鉴定全转录组m⁶A位点与丰度。
分辨率：~100–200nt区域水平（取决于片段长度）。
适用场景：绘制细胞/组织全转录组m⁶A图谱；比较不同处理/疾病模型的m⁶A差异；与RNA-seq联用，研究甲基化对表达、剪接、翻译的影响。
优点：覆盖全转录组，灵敏度高；技术成熟，生信流程标准化；可与转录组等多组学整合。
缺点：分辨率仍在百碱基级，无法精确定位到单碱基；抗体批次差异和富集偏好可能导致假阳性；需设置input对照以校正表达量差异。

MeRIP-seq流程

4. miCLIP-seq（m6A-CLIP-seq）

原理：活细胞交联（UV）将m⁶A抗体与RNA共价固定→免疫沉淀→逆转录时交联位点产生特异突变/截短→高通量测序，通过突变信号精确定位m⁶A位点。
分辨率：单核苷酸。
适用场景：单碱基级m⁶A图谱、甲基化转移酶/去甲基酶靶点鉴定。
优点：目前唯一抗体依赖、单碱基分辨率的m⁶A检测技术；可同时获得m⁶Am信息；可与其他组学数据联合分析。
缺点：步骤繁琐（交联、胶回收、突变分析），实验周期长；抗体批次差异和交联效率影响重复性；对生信分析要求较高，需专门突变调用流程。

MiCLIP-seq流程

5. Nanoporedirect RNA-seq（DRS）

原理：RNA不经逆转录和PCR，直接由马达酶牵引穿过纳米孔；通过实时电流信号差异一次获得序列、m⁶A、m⁵C等修饰及poly(A)尾长度。
分辨率：接近单碱基，可定位到修饰位点；读长即全长转录本，无长度限制。
适用场景：全长转录本+修饰联合分析。
优点：保留天然RNA特征，无逆转录/扩增偏差；一次实验可同时检测多种修饰并估算poly(A)长度；可发现新型异构体与融合转录本。
缺点：单次错误率约5–10%，需高覆盖矫正；建库成本仍高于二代；修饰识别依赖训练模型，跨物种需重新训练。

DRS原理

6. RNA亚硫酸氢盐测序（RNA-Bisseq）

原理：先用重亚硫酸氢盐处理RNA，未甲基化的胞嘧啶（C）脱氨成尿嘧啶（U），而5-甲基胞嘧啶（m⁵C）保持不变；随后逆转录、PCR扩增，通过比对C→T转化情况即可在单碱基水平定位并定量m⁵C位点。
分辨率：单核苷酸。
适用场景：特异性检测m⁵C修饰，适用于研究m⁵C的分布和功能。
优势：可精准定位m⁵C修饰位点；无需抗体，避免富集偏好。
局限：仅适用于m⁵C修饰，对样本质量要求较高；RNA二级结构区域转化不完全，可能产生假阳性；亚硫酸氢盐处理易导致RNA降解，需优化反应条件。

RNA-Bisseq原理

第三类

甲基化位点验证

适用于特定基因或区域的甲基化验证。

7. MeRIP/MiCLIP-qPCR

原理：先用MeRIP（或MeCLIP）免疫沉淀富集带m⁶A修饰的RNA片段（IP），同时留Input对照；随后对目标区域做qPCR，以%IP/Input或Fold enrichment值量化该区域的m⁶A修饰水平。
分辨率：MeRIP-qPCR为100–200nt区段；MiCLIP-qPCR可达单碱基。
适用场景：高通量测序（MeRIP-seq/MiCLIP-seq）后，对候选基因/位点进行验证；小样本快速比较不同处理组的m⁶A修饰差异。
优点：实验周期短、成本低；定量准确，与测序结果互补。
缺点：一次只能检测少数已知区域；需要优化抗体富集效率和qPCR引物特异性；IgG或突变信号需严格对照，避免非特异背景。

MeRIP-qPCR流程

8. SELECT（Site-Specific Cleavage and Ligation-Enhanced qPCR）

原理：该技术基于引物延伸阻断与连接反应，能在单碱基分辨率下特异检测目标RNA位点的甲基化修饰，并结合qPCR定量分析。该方法灵敏度高，适合m⁶A等修饰的位点精确定量验证。
分辨率：单核苷酸，可精确定位并定量一个特定位点的m⁶A水平。
适用场景：高通量测序后候选位点的快速验证；低丰度RNA（tRNA、snRNA）或小样本的绝对定量；需要精确比例（%m⁶A）而非富集峰的研究。
优点：单碱基精度+绝对定量；对低丰度RNA仍灵敏；无需抗体，避免批次差异。
缺点：一次只能检测1个位点，无法高通量；Bst延伸与SplintR连接效率受探针设计影响，需严格阴性/阳性对照；若位点两侧二级结构复杂，易出现假阳性/阴性。