【科研知识】常用细胞增殖检测方法
上期文章写到细胞增殖的检测方法有好多种，而我司常用的是MTT法、CCK-8法、CTL化学发光法以及EdU488法。本期就这四种方法详细展开讲讲它们的原理、实验步骤以及优缺点。
一、MTT法
MTT（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide）是一种接受氢离子的黄色染料，商品名为噻唑蓝，1983年Mosmann建立MTT比色法，用于检测细胞存活和增殖。
原理：
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜（Formazan），并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值（OD值），可间接反映活细胞数量。在一定的细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的OD值来判断活细胞数量，OD值越大，细胞数量越多或活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
图1 活细胞中MTT四唑盐还原为甲臜示意图（Buranaamnuay K., 2021）。
实验流程：
（1）细胞铺板：一般用96孔板，收集对数期细胞，铺板密度为1×104/孔，每孔加100μL细胞重悬液，过夜培养；
（2）药物处理：根据实验目的选做；一般是前一天铺板，次日加药；
（3）加MTT：吸去细胞培养上清，每孔加入80~90μL培养基+10~20μL MTT溶液(MTT占比10~20%)，继续培养4h；
（4）加DMSO：终止培养，小心吸去孔板内的细胞培养液，每孔加入100~150μL DMSO，置于摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；
（5）酶标仪检测：在570nm测量各孔的吸光值。
优缺点：
优点：简便、灵敏、经济、快速且无放射性，可用于所有细胞类型。
缺点：MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，不仅增加工作量，还影响实验结果的准确性，且溶解甲瓒的有机溶剂有毒性。
二、CKK-8法
CCK-8是MTT的升级版，其检测试剂中含有WST-8——一种类似于MTT的化合物。WST-8是近年新开发的一种较WST-1更新的水溶性四唑盐，其检测灵敏度比MTT、XTT及MTS更高，尤其适合于悬浮细胞和高通量药物筛选。更重要的是，CCK-8细胞毒性低，细胞经检测后还可重复利用，具有更好的实用性，可替代MTT法，具有良好的应用前景。
原理：
WST-8在电子耦合试剂1-Methoxy PMS（1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯）的作用下，可被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物。生成的甲臜物数量与活细胞数量成正比。用酶标仪在450nm波长处测定其OD值，可间接反映活细胞数量，细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。
图2 CCK-8检测原理图。
实验流程：
（1）细胞铺板：一般用96孔板，收集对数期细胞，铺板密度为1×104/孔，每孔加100μL细胞重悬液，过夜培养；
（2）药物处理：根据实验目的选做；一般是前一天铺板，次日加药；
（3）加CCK-8：每孔加入10μL CCK溶液，继续培养3-4h；
（4）酶标仪检测：在450nm测量各孔的吸光值。
优缺点：
优点：
1、产生的甲瓒产物是水溶性的，可减小实验误差；
2、不需要放射性同位素和有机溶剂，对细胞的毒性小；
3、重复性优于MTT法；
4、检测试剂无需预制，即开即用；
5、灵敏度高，线性范围宽，数据可靠，重现性好；
6、操作简便，省时省力；
7、适合于高通量药物筛选。
缺点:
1、与MTT法相比，CCK-8价格较贵；
2、试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，操作过程中容易多加或漏加。
三、CellTiter-Glo发光活细胞检测系统
CellTiter-Glo（CTG）是基于ATP检测的快速细胞活力检测法，是公认的高灵敏度发光检测法，是细胞活力检测的金标准，在国内外被广泛应用。
原理：
ATP腺嘌呤核苷三磷酸（简称三磷酸腺苷）参与生物体内多种酶促反应，是活细胞新陈代谢的一个指标，其含量直接反应了细胞的数量及细胞状态。实验过程中向细胞培养基加入等体积CTG试剂，利用荧光素酶Luciferase与其底物荧光素Luciferin的生物发光为基础，如果有ATP存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比，而ATP又和活细胞数呈正相关。因此可在光信号和体系中，测量发光值，通过检测ATP含量得到细胞活力。
图3 CTG发光检测原理。
实验流程：
（1）细胞铺板：收集对数期细胞，96孔板铺板密度为1×104/孔，每孔加100μL细胞重悬液，培养至正常生长阶段；
（2）药物处理：根据实验目的选做；
（3）ATP标准曲线的设置：把自备的ATP标准溶液用PBS或细胞培养液稀释成适当的浓度梯度；
（4）加CTG：按照96孔板每孔100μL，室温振荡2min，孵育10min；
（5）酶标仪检测：使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。
优缺点：
优点：
1、CTG和细胞培养中的常用培养基兼容，如RPMI 1640、MEM、DMEM、Ham's F12等，也不受酚红和有机溶剂的影响；
2、线性范围宽、发光强度高、检测灵敏度高、稳定性好；
3、操作简单，读数稳定，检测速度快，完成检测仅需约10分钟。
缺点：价格很贵，成本太高。
四、EdU法
EdU检测法是BrdU的替代方法，也是目前更广泛适用的方法。EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中。
原理：
通过EdU与Apollo荧光染料的特异性共轭反应，使得染料标记到EdU插入的增殖中的细胞，进而快速检测细胞DNA复制活性。
图4 EdU反应原理（Endaya B B., 2016）。
实验流程：
（1）细胞铺板：按每孔1×105~3×106个细胞接种于6孔板中，培养至正常生长阶段；
（2）药物处理：根据实验目的选做；
（3）EdU标记：EdU的标记浓度应根据所用的细胞类型做相应的优化选择，建议以10μM的EdU初始浓度进行摸索；
（4）固定：加入细胞固定液（含4%多聚甲醛）室温育30min，弃掉固定液，用洗涤液洗涤细胞3次，每次3~5min；
注：对于流式细胞仪检测，贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬后再固定；
（5）通透：去除洗涤液，加入通透液，室温孵育10~15min，去除通透液，用洗涤液洗涤细胞1~2次，每次3~5分钟；
（6）加Click：去除洗涤液，加入Click反应液室温避光孵育30min，吸除反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3~5min；
（7）EdU检测：可在荧光显微镜下观察，或者使用流式细胞仪、多功能酶标仪进行荧光检测。
优缺点：
优点：
1、更简单：无需抗原抗体反应，基于小分子化学反应的检测方法简单高效，反应仅需要几分钟；
2、更灵敏：无需抗体，检测染料仅BrdU抗体的1/500，很容易扩散，即便是单个增殖细胞也能准确检测；
3、更快速：无需过夜，省却了抗原抗体反应的复杂繁琐步骤，完成整个检测周期仅需5h；
4、更准确：无需DNA变性（酸解、热解、酶解等），可有效避免变性带来的样品损伤，确保细胞核边缘清晰完整；
5、更兼容：对样品几乎无损伤，更容易与多种抗体或荧光蛋白同时标记，能够同时检测细胞其他性状特征；
6、多种染料可选，适用于各种动物细胞检测，对植物细胞亦适用。
参考文献
Buranaamnuay K. The MTT assay application to measure the viability of spermatozoa: A variety of the assay protocols. Open Vet J. 2021;11(2):251-269.
Endaya B B. Detecting Proliferating Tumour Cells for their Molecular Characterisation[J]. 2016.