sc-atac的基础知识（0）
sc-atac的基础知识
**fragment**是ATAC-seq实验中的一个重要概念，它指的是通过Tn5转座酶对DNA分子进行酶切，然后经由双端测序得到的序列。
根据Tn5插入导致的偏移从read比对得到的位置推断出fragment的起始和结束位置。根据之前的报道，Tn5转座酶以同源二聚体的形式结合到DNA上，在两个Tn5分子间隔着9-bp的DNA序列。根据这个情况，每个Tn5同源二聚体的结合事件会产生2个Insertions，中间隔着9bp。因此，真实的"开放"位置的中心在Tn5二聚体的正中间，而不是Tn5的插入位置。为了尽可能的还原真实情况，我们对Tn5的Insertions进行了校正，即正链的插入结果往右移动4bp(+4 bp), 负链的插入结果往左偏移5bp(-5 bp)。这个和最早提出的ATAC-seq里的描述是一致的。因此，在ArchR中，"fragment"指的是一个table或genomic ranges对象, 记录在染色体上，经过偏移校正后的单碱基起始位置，以及经过偏移校正后单碱基结束位置，每个fragment都会对应唯一的细胞条形码。类似的，"Insertions"这得是偏移校正后的单碱基位置，它位于开放位置的正中心。（https://www.jianshu.com/p/f7975da8e1e8）
- Tn5 转座酶（绿色剪刀图标）只能切割 开放染色质（Open chromatin，线条松散）。
- 在封闭染色质（Closed chromatin，线条紧密）处，Tn5 无法进入，因此不切割。
- Tn5 在开放区域切割后，插入测序接头（adapters，灰色小条），形成 可测序的 DNA 片段。
- 这些片段经过 PCR 扩增 & 测序，最终得到 开放染色质信号峰。
“只有染色质松开的区域才会被 Tn5 切割并变成可测序的 ATAC 片段。”
Tn5 转座酶是同源二聚体
什么是同源二聚体，组蛋白是八聚体吗？两者什么区别
一句话区分：
- 同源二聚体 = 2 个相同蛋白抱在一起；
- 组蛋白八聚体 = 8 个不同组蛋白（2×H2A、2×H2B、2×H3、2×H4）按固定比例拼成核小体核心。
1 同源二聚体（homo-dimer）
- 定义：由 两条完全相同的肽链/蛋白 非共价结合而成的功能单位。
- ATAC-seq 场景：Tn5 转座酶只有 两条一模一样的 Tn5 分子 同时结合 DNA，才能切割并插入接头。
2 组蛋白八聚体（histone octamer）
- 组成：
(H2A-H2B) × 2 (H3-H4) × 2 共 8 条肽链 - 功能：绕成核小体核心，把 DNA 缠成“线轴”。
3 核心差异
| 维度 | 同源二聚体 | 组蛋白八聚体 |
|---|---|---|
| 链数 | 2 条相同蛋白 | 8 条不同蛋白 |
| 蛋白种类 | 1 种 | 4 种（H2A、H2B、H3、H4） |
| 生物学角色 | 酶活性单位（如 Tn5） | 染色质结构骨架 |
| 是否完全相同 | ✅ 是 | ❌ 否 |
根据之前的报道，Tn5转座酶以同源二聚体的形式结合到DNA上，在两个Tn5分子间隔着9-bp的DNA序列。什么意思
意思是：
Tn5 转座酶只有两条完全相同的酶链（同源二聚体）同时抓住 DNA，它们之间被 9 个碱基对（9 bp）的 DNA 片段隔开；
- 正链酶切在 +4 bp 处
- 负链酶切在 -5 bp 处
校正后，这两个切点中间正好留下 9 bp 的“间隙”，真正的开放染色质中心就在这段间隙的正中间。
根据这个情况，每个Tn5同源二聚体的结合事件会产生2个Insertions，中间隔着9bp。什么是Insertions
在 ATAC-seq 里，Insertion 指的是 Tn5 转座酶在 DNA 上实际切割并把测序接头“插入”进去的那一个单碱基点。
- 一个 Tn5 同源二聚体结合事件会 同时切两下，因此 产生 2 个这样的插入点（两条链各一个）。
- 这两个插入点之间正好隔着 9 bp 的 DNA 片段。
Insertions与Fragment的区别
-
Insertions 是 单个碱基点（Tn5 二聚体中心），
例如 chr1:1000（正链 +4 校正后）。 -
Fragment 是 一条线段（起点—终点），
例如 chr1:1000–1001（起点 1000，终点 1001），长度 1 bp，正好以 Insertion 点为中心。
因此，Insertion 位于 Fragment 的正中间，两者校正后的坐标只差一个“线段宽度”，方向相反的两端各 1 bp。
为什么使用ArchR
- 行标题：表示不同的功能模块，如数据导入（Data import）、双细胞去除（Doublet Removal）、基因得分（Gene Scores）、聚类（Clustering）、标准ATAC-seq分析（Standard ATAC-seq Analyses）、数据可视化（Data Visualization）和高级ATAC-seq分析（Advanced ATAC-seq Analyses）等。
ArchR通过优化数据结构降低了内存消耗，使用并行提高了运行速度，因此保证其性能优于其他同类型工具
什么是Arrow文件/ArchRProject
proj <- ArchRProject(ArrowFiles = ArrowFiles,genomeAnnotation = genomeAnnotation,geneAnnotation = geneAnnotation,copyArrows = TRUE
)
- Arrow 文件的作用
- Arrow 文件：是 ArchR 项目中用于存储每个独立样本所有相关信息的文件格式。这些信息包括元数据（如样本名称、实验条件等）、开放的染色质片段（fragments）以及数据矩阵等。
- 独立样本：每个 Arrow 文件对应一个独立样本，这个样本最好是详尽的分析单元，例如在特定实验条件下的单个重复实验。
- Arrow 文件的内容
- 文件内容：Arrow 文件记录了每个样本的所有相关信息，这些信息对于后续的分析至关重要。
- 文件路径：Arrow 文件实际上是存储在磁盘上的 HDF5 文件，而不是内存中的 R 对象。
·Arrow 文件：存储在磁盘上的文件，使用 HDF5 格式，可以存储大量数据，并且支持快速读取和写入。
·R 对象：存储在内存中的数据结构，用于数据处理和分析，但不适合存储大量数据，因为内存容量有限。
- ArchR 处理 Arrow 文件的方式
- 编辑和更新：在创建 Arrow 文件以及进行一些附加分析时，ArchR 会编辑和更新相应的 Arrow 文件，添加额外的信息层。
- 高效访问：通过使用 ArchRProject 对象，ArchR 可以将多个 Arrow 文件关联到一个分析框架中，从而确保在 R 中能高效访问这些文件。
- ArchRProject 对象的作用
- 内存占用：ArchRProject 对象本身占用的内存不多，因为它主要负责关联磁盘上的 Arrow 文件，而不是存储文件内容本身。
- 分析框架：ArchRProject 对象将多个 Arrow 文件关联到一个分析框架中，使得在 R 中可以高效地访问和处理这些文件。
- 总结
- Arrow 文件：存储每个样本所有相关信息的 HDF5 文件，存储在磁盘上。
- ArchRProject 对象：用于关联多个 Arrow 文件，使其在 R 中高效访问，占用内存少。
- 处理流程：在创建和分析过程中，ArchR 会更新 Arrow 文件，添加额外信息层，以支持复杂的数据分析。
这张图展示了 ArchR 项目中== Arrow 文件==和 ArchRProject 对象的结构和内容，以及它们在存储和内存中的不同格式。
左侧：Arrow 文件（存储在磁盘上）
- 格式：HDF5 格式，文件体积较大。
- 内容：
- Metadata（元数据）：
- 样本中心元数据（Sample-centric Metadata）
- 细胞中心元数据（Cell-centric Metadata）
- 基因组注释（Genome Annotation，DNA）
- Sequence-derived data（序列衍生数据）：
- 可访问区域（Accessible Regions，Fragments）
- 500 bp 的片段（Tiles）
- 基因得分矩阵（Gene Score Matrix）
- 峰值（Peaks）
- 峰值计数矩阵（Peak Count Matrix）
- 转录因子偏差矩阵（TF Deviation Matrix）
- 细胞类型矩阵（Cell Type Matrix）
- Metadata（元数据）：
右侧：ArchRProject 对象（加载到内存中）
- 格式：RDS 格式，文件体积较小。
- 内容：
- Metadata（元数据）：
- 样本中心元数据（Sample-centric Metadata）
- 细胞中心元数据（Cell-centric Metadata）
- 基因组注释（Genome Annotation，DNA 和转录本）
- High-level Project Data（高级项目数据）：
- 降维/嵌入（Dim. Reduction / Embeddings，如 LSI、t-SNE、UMAP）
- 峰值集合（Peak Set，包括染色体位置、起始、终止位置）
- 峰值注释（Peak Annotation，包括 Motifs、SNPs、Features）
- Metadata（元数据）：
总结
- Arrow 文件存储了单细胞 ATAC-seq 数据的原始信息，包括元数据和序列衍生数据，文件体积较大，存储在磁盘上。
- ArchRProject 对象是一个内存中的对象，包含了 Arrow 文件的索引和一些高级分析数据，文件体积较小，便于在内存中快速访问和处理。
- 通过使用 ArchRProject 对象，可以高效地访问和管理磁盘上的 Arrow 文件，同时利用内存中的对象进行快速分析。
有一些操作会直接修改Arrow文件，而一些操作会先作用于ArchRproject，接着反过来更新每个相关Arrow文件。因为Arrow文件是以非常大的HDF5格式存放，所以ArchR的get-er函数通过和ArchRProject进行交互获取数据，而add-er函数既能直接在Arrow文件中添加数据，也能直接在ArchRpoject里添加数据，或者通过ArchRpoject向Arrow文件添加数据。