无细胞蛋白表达｜线性DNA快速表达｜高效体外合成系统

无细胞表达（Cell-Free Expression, CFE）是一种在体外环境中合成蛋白质的生物技术。它通过将细胞内用于转录和翻译的分子组分提取出来，重构一个能够驱动蛋白质合成的反应体系。该技术不依赖活细胞，因而具备高度开放性和可控性，为基础研究和合成生物学提供了灵活而高效的工具。

一、无细胞表达的原理

无细胞表达系统通过从生物细胞中提取细胞裂解物（含有核糖体、tRNA、转录因子、酶等），并加入核苷酸、氨基酸、能量再生系统和DNA或mRNA模板，在体外完成转录和翻译过程。

蛋白质的合成分两个阶段进行：

转录（Transcription）：DNA模板在RNA聚合酶作用下转录成mRNA。

翻译（Translation）：mRNA在核糖体上被翻译为蛋白质链，随后折叠为具有功能的蛋白分子。

由于无需细胞生长和繁殖，反应时间大大缩短，体系中组分明确，便于调控与干预。

二、主要无细胞表达体系简介

目前常用的无细胞表达体系多来源于不同生物物种的细胞裂解物或重组蛋白系统。常见体系包括：

E. coli 体系：基于大肠杆菌裂解液构建，反应效率高，广泛用于基础研究和技术开发。

小麦胚芽体系：源自植物细胞，更适合表达真核蛋白，特别是结构复杂或含有二硫键的蛋白质。

兔网织红细胞体系：具有良好的翻译能力，可表达多种哺乳动物蛋白，适用于功能验证实验。

CHO体系：提供接近哺乳动物细胞的翻译环境，支持糖基化等翻译后修饰。

PURE体系：由纯化的蛋白质和rRNA等组分组装而成，成分高度可控，适合机制研究和合成生物学。

三、模板类型与表达策略

无细胞表达系统可使用多种模板类型，包括：

环状质粒DNA：传统的表达模板，稳定性高。

线性DNA片段：由PCR或合成获得，无需克隆步骤，可直接使用，适合快速构建表达体系。

体外转录的mRNA：用于仅需翻译过程的表达系统，避开DNA污染风险。

根据实验目的，可设计融合标签（如His-tag、FLAG-tag）以便于纯化与检测，也可加入调控元件以控制表达水平。

四、表达产物与评估方式

无细胞体系的产物可为可溶蛋白、包涵体或膜蛋白，具体形式取决于蛋白本身特性与体系条件。常用的表达评估方式包括：

SDS-PAGE 与 Coomassie 染色

Western blot 检测特异性表达

功能检测（酶活、结合实验）

蛋白定量分析（BCA, Bradford 等）

此外，加入辅因子、折叠辅助因子或脂质体，可进一步提高蛋白质功能性或适配膜蛋白表达。

无细胞蛋白合成技术已从早期的基础研究平台发展为具备可扩展性的合成平台。它被广泛用于研究转录翻译机制、蛋白质相互作用、蛋白折叠调控等问题。近年来，随着系统合成优化和模块化设计的发展，无细胞表达逐渐成为蛋白工程、RNA合成和人工细胞构建等领域的重要基础技术。

相比传统表达方式，无细胞系统更开放、更可控，更易实现自动化与高通量组合实验，是推动合成生物学与生物制造革新的关键工具之一。

常见问题 FAQ

Q1：无细胞蛋白表达与传统细胞表达有什么不同？
A： 无细胞表达不依赖活细胞增殖，直接在体外体系中进行转录翻译。它更快速、可控，尤其适用于毒性蛋白、高通量筛选和快速原型开发等场景。

Q2：线性DNA和质粒在无细胞系统中都能用吗？
A： 大多数无细胞体系支持线性DNA表达，尤其适合快速构建筛选。质粒表达更稳定，适用于长期反应或大规模合成。

Q3：无细胞体系可以表达真核蛋白吗？
A： 使用来源于哺乳动物、昆虫或植物细胞的裂解液（如CHO、小麦胚芽体系）可高效表达真核蛋白，部分体系还能进行糖基化等翻译后修饰。

Q4：无细胞平台能否表达膜蛋白或毒性蛋白？
A： 无细胞系统提供安全、可控的表达环境，是表达膜蛋白和毒性蛋白的有效替代方案。

Q5：无细胞表达的蛋白功能完整吗？
A： 多数目标蛋白通过体系优化后可获得良好折叠和功能活性，尤其在真核体系中表现更佳。

Q6：是否支持mRNA直接翻译？
A： 部分无细胞体系支持mRNA模板翻译，常用于疫苗研发、体外合成研究等领域。

Q7：一个无细胞表达反应一般多长时间？
A： 最快4–6小时内即可完成整个流程，大幅缩短实验周期。