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在细胞生物学研究中，细胞活性检测是基础且关键的实验环节。然而，传统方法在检测活细胞和死细胞时常常面临诸多挑战：例如，检测过程复杂、耗时，容易受到细胞类型和实验条件的限制；荧光信号不稳定，难以准确区分活细胞和死细胞；或者需要昂贵的设备支持，增加了实验成本。这些问题不仅影响实验效率，还可能导致结果偏差，给科研人员带来诸多困扰。AbMole推出的Calcein-AM/PI活死细胞双染试剂盒（AbMole，M55257），专为解决这些痛点而设计，它的检测原理基于两种荧光染料：Calcein-AM和碘化丙啶（PI），能够快速、准确地区分活细胞和死细胞，为细胞活性检测提供了一种高效、便捷且可靠的解决方案。AbMole为全球科研客户提供高纯度、高生物活性的抑制剂、细胞因子、人源单抗、天然产物、荧光染料、多肽、靶点蛋白、化合物库、抗生素等科研试剂，全球大量文献专利引用。
一、检测原理
Calcein-AM/PI活死细胞双染试剂盒（AbMole，M55257）内含有Calcein-AM和Propidium Iodide（PI，碘化丙啶），Calcein AM 是在传统的钙黄绿素（Calcein）上添加了乙酰甲氧基甲酯即（AM）基团，导致其具有较强的疏水性，因此容易穿过细胞膜进入胞内。Calcein AM本身无荧光，在进入细胞后被细胞中内源性酯酶水解，生成具有强负电荷且不能通过细胞膜的极性分子Calcein并滞留在细胞内，而Calcein可发出强绿色荧光（Ex/Em= 494nm/517nm）[1]。由于死细胞缺乏上酯酶，不能或很少能产生Calcein，因此仅活细胞会被染色为强绿色荧光，死细胞不能被染色。PI则是一种无法透过活细胞膜的染料，由于死细胞的细胞膜选择透过性丧失，PI可以进入胞内与双链DNA特异性结合产生强烈的红色荧光（Ex/Em=535nm/617nm），从而对死细胞进行标记[2]。因此，上述两种染料的联合使用，可以对活细胞与死细胞同时进行双重荧光染色，用于实验中细胞活性或细胞毒性的检测。用490nm激发时可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞；而用545nm激发时仅可观察到死细胞。2014年，AbMole的两款抑制剂分别被西班牙国家心血管研究中心和美国哥伦比亚大学用于动物体内实验，相关科研成果发表于顶刊 Nature 和 Nature Medicine。
图1. 活死细胞染色试剂盒的检测原理
二、优势
AbMole的Calcein-AM/PI活死细胞双染试剂盒（AbMole，M55257）具有多种优势，主要包括以下几点：
- 快速检测：操作简单，染色过程仅需40分钟左右，无需复杂的前处理步骤，大大节省了实验时间。
- 高灵敏度：Calcein-AM和PI的荧光信号清晰明亮，能够准确区分活细胞和死细胞，即使在细胞密度较低的情况下也能获得可靠的检测结果。
- 广泛适用性：适用于多种细胞类型，包括贴壁细胞、消化后的悬浮细胞以及原代细胞，不受细胞种类限制。对设备要求较低，普通荧光显微镜或者使用酶标仪即可完成检测，降低了实验成本。
- 稳定可靠：试剂稳定性高，荧光信号持久，不易淬灭，使实验结果具有重复性和可靠性。
三、范例详解
研究者们开发了一种无载体的“特洛伊木马”直径可变金属-有机纳米诊疗剂，通过配位驱动的超分子顺序共组装抗肿瘤抑制剂PEM、过渡金属离子（FeIII）和血管生成抑制剂假辣木酸B（PAB）。该纳米制剂可有效抑制肿瘤血管的生成。在细胞实验中，科研人员使用了由AbMole提供的Calcein-AM/PI活死细胞双染试剂盒（AbMole，M55257）检测HeLa、HTdMEC 和 HUVEC 细胞的细胞活力[3]。
图2. Fluorescence images of live/dead staining assay of HeLa and HTdMEC cells cultured with different formulations[3].
AbMole是ChemBridge中国区官方指定合作伙伴。
参考文献
[1] HOLLó Z, HOMOLYA L, DAVIS C W, et al. Calcein accumulation as a fluorometric functional assay of the multidrug transporter [J]. Biochimica et biophysica acta, 1994, 1191(2): 384-8.
[2] NICOLETTI I, MIGLIORATI G, PAGLIACCI M C, et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry [J]. Journal of immunological methods, 1991, 139(2): 271-9.
[3] FAN Z, SHI D, ZUO W, et al. Trojan-Horse Diameter-Reducible Nanotheranostics for Macroscopic/Microscopic Imaging-Monitored Chemo-Antiangiogenic Therapy [J]. ACS applied materials & interfaces, 2022, 14(4): 5033-52.