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GuPPy：Python中用于光纤光度数据分析的免费开源工具

 01 背景

Basecalling 是将原始测序信号转换为碱基序列的过程，通俗地说，就是“把碱基识别出来”。这一过程在不同代测序技术中各不相同：

• 一代测序是通过解析峰图实现；

• 二代测序则是对荧光图像进行处理；

• 而三代测序中的 Nanopore 技术 则是通过电信号，即电流强度的变化，来推断通过纳米孔的碱基。

由于每次测量的是多个碱基的叠加信号，识别过程更为复杂。因此，碱基识别算法仍在不断发展和优化中。

目前，Oxford Nanopore Technologies (ONT) 官方推荐的 basecalling 工具是 Guppy。在此之前曾使用过 Albacore，后续还有可能被更新的工具（如 Flappie）所替代。这也从侧面反映出该领域仍有广阔的优化空间，是当前测序研究的重要方向之一。

尽管存在如 poretools、nanopolish 等多种第三方工具，但在 basecalling 任务中，仍建议首选官方工具。毕竟，硬件由 ONT 提供，他们对信号特征的理解更加深入。此外，Nanopore 的 basecalling 与所用芯片类型密切相关，例如：

• DNA 分子在纳米孔中以约 450 bp/s 的速度通过；

• RNA 分子则较慢，约为 70 bp/s。

这一差异也决定了其识别算法存在本质上的不同。

Guppy 简介

Guppy 是 Oxford Nanopore 官方提供的碱基识别软件，是一个基于命令行的工具。

Guppy 主要包含以下几项核心功能：

1. 碱基识别
   Guppy 的核心功能是将电流信号转换为 DNA 或 RNA 碱基序列。其底层算法基于循环神经网络（RNN），可以准确识别五种标准碱基：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）以及尿嘧啶（U）。

2. 条形码拆分（Demultiplexing）
   如果文库构建中添加了条形码（barcode），Guppy 可自动识别两端的条码序列，并将样本数据进行拆分。这一过程类似于 Illumina 测序中基于 index 的样本区分。

3. 参考序列比对
   Guppy 支持将识别后的碱基序列与参考基因组进行比对，底层实际上调用的是 minimap2 工具。由于该功能中 minimap2 的参数设置是内嵌的，不可调整，建议用户在比对任务中使用独立的 minimap2 工具，以确保更高的灵活性与精度。

4. 甲基化修饰检测
   Guppy 还具备一定的碱基修饰检测能力。当碱基发生如甲基化等修饰时，其通过纳米孔时的电信号会表现出异常。Guppy 可通过识别这些“离群”信号推测潜在修饰位点。
   目前该功能仍依赖于特定的训练数据集，支持的物种有限（如大肠杆菌、人类等模式生物）。若对特定物种感兴趣，可尝试构建定制训练集进行检测。

https://github.com/LernerLab/GuPPy   #官网
wget -c https://github.com/LernerLab/GuPPy/archive/refs/tags/v1.2.0.zip    #new version

02下载

下载 GuPPy 代码

a. 点击页面右上角绿色的 “Code” 按钮，会弹出下拉菜单。
b. 点击 “Download ZIP” 下载压缩包（注意：请保存在本地硬盘中，不要保存在iCloud、OneDrive、Box等云端，建议保存至 C盘 用户文件夹）。
c. 解压下载的ZIP文件，得到文件夹 “GuPPy-main”，并将其放在一个方便的位置（避免使用云同步文件夹）。
d. 记下 “GuPPy” 子文件夹的路径，在后续操作中会用到。

• Mac：右键文件夹 → 点击“显示简介” → 查看“位置”字段

• Windows/Linux：右键文件夹 → 属性 → 查看“位置”字段
  示例：/Users/LernerLab/Desktop/GuPPy-main

03 安装

conda安装

cd 路径_to_GuPPy_folder
示例：cd /Users/LernerLab/Desktop/GuPPy-main创建并激活 GuPPy 环境
依次输入以下命令：注意：filename 替换为你的系统对应的配置文件：Windows: spec_file_windows10.txtMac: spec_file_mac.txtLinux: spec_file_linux.txtconda create --name guppy --file filename
conda activate guppy

04 使用

启动 GuPPy 用户界面
输入以下命令以启动GUI界面：panel serve --show GuPPy/savingInputParameters.ipynb
此时，GuPPy 已成功安装并可开始使用！卸载 GuPPy
若需卸载：conda remove --name guppy --all

05 官方教学视频

• Installation steps
• Explaining Input Parameters GUI
• Individual Analysis steps
• Artifacts Removal
• Group Analysis steps
• Use of csv file as an input
• Use of Neurophotometrics data as an input

06 官方示例数据

• Sample data for the user to go through the tool in the start. This folder of sample data has two types of sample data recorded with a TDT system : 1) Clean Data 2) Data with artifacts (to practice removing them) 3) Neurophotometrics data 4) Doric system data. Finally, it has a control channel, signal channel and event timestamps file in a 'csv' format to get an idea of how to structure other data in the 'csv' file format accepted by GuPPy.

 07 常用 Basecall

7.1 基本命令格式

通过 guppy_basecaller -h 可查看工具的基本使用方式：

guppy_basecaller -i <输入路径> -s <输出路径> -c <配置文件> [options]

常用参数说明：

• -i：输入文件夹（包含 .fast5 文件）

• -s：输出文件夹（保存 fastq 或 bam 文件）

• --config：指定 basecall 配置文件

• -r / --recursive：递归处理子目录

• --flowcell：芯片类型（如 FLO-MIN106、FLO-MIN107）

• --num_callers：并行处理数（通常影响输出文件数量）

• --cpu_threads_per_caller：每个 caller 使用的 CPU 线程数

• --compress_fastq：输出压缩格式的 fastq 文件

• -q：每个输出文件中包含的最大读段数（设为 0 表示每个读段单独输出）

• --disable_qscore_filtering：禁用质量分数过滤，保留低质量读段

• --align_ref：参考基因组 FASTA 或索引文件

• --model_file：指定模型文件

• --device / -x：设置使用的 GPU（如 cuda:0、cuda:1,2 或 auto）

• --bed_file：指定包含感兴趣区域的 .bed 文件

• --align_type：设置比对模式（auto、full 或 coarse）

• --minimap_opt_string：传递 minimap2 的自定义参数

• --bam_out：输出 BAM 格式文件

• --index：生成 BAM 索引

• --moves_out：在 BAM 文件中输出碱基移动信息

7.2 使用配置文件 (-c) 进行 Basecall

最基础的 basecall 命令如下，可按需调整参数：

guppy_basecaller \-i fast5_files/ \-s output/ \--config dna_r9.4.1_450bps_sup.cfg \--model_file $HOME/bio/tools/ont-guppy-cpu/data/template_r9.4.1_450bps_hac.jsn \--disable_qscore_filtering \-r \--align_ref refs/dna.fa

7.3 通过 Flow Cell 和 Reagent Kit 指定模型

若未使用 --config 指定模型，可通过 flow_cell 和 kit 参数自动选择合适配置。

查看支持的芯片和试剂盒：

​guppy_basecaller --print_workflows

过滤特定组合（例如：FLO-MIN106 与 SQK-LSK109）：

​guppy_basecaller --print_workflows | grep FLO-MIN106 | grep SQK-LSK109

示例输出：

​FLO-MIN106  SQK-LSK109  dna_r9.4.1_450bps_hac  2021-05-17_dna_r9.4.1_minion_384_d37a2ab9

使用该组合进行 basecall：

guppy_basecaller \-i fast5_files/ \-s output/ \--flowcell FLO-MIN106 \--kit SQK-LSK109 \--model_file $HOME/tools/ont-guppy-cpu/models/template_r9.4.1_450bps_hac.jsn

7.4 使用自定义模型进行 Basecall

如使用自定义训练模型（如 Taiyaki 训练的模型）：

1. 导出模型为 JSON 格式：

dump_json.py training/model_final.checkpoint > model.json

1. 使用该模型进行 basecall：

可结合 Guppy + Megalodon 等工具进行碱基修饰检测（如甲基化）等！

08 引用

Venus N. Sherathiya, Michael D. Schaid, Jillian L. Seiler, Gabriela C. Lopez, and Talia N. Lerner GuPPy, a Python toolbox for the analysis of fiber photometry data. Sci Rep 11, 24212 (2021). GuPPy, a Python toolbox for the analysis of fiber photometry data | Scientific Reports