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1. 安装必要的软件和包

在开始之前，你需要确保系统中已经安装了以下软件和包：

• Perl (v5.22.1)
• Perl 模块 (Statistics::Distributions)
• R (v3.2.5)
• R 包 (ggplot2)
• BWA (v0.71)
• GATK (v4.1.0.0)
• Picard (v1.119)

安装这些软件和包的步骤在文档中已经提供了链接，你可以按照以下步骤进行安装：

• 安装 Perl：访问 https://www.perl.org/get.html
• 安装 R：访问 https://www.r-project.org/
• 安装 BWA：访问 https://github.com/lh3/bwa
• 安装 GATK：访问 https://software.broadinstitute.org/gatk/
• 安装 Picard：访问 https://broadinstitute.github.io/picard/

安装这些工具可能需要一些时间，预计在两小时内完成。

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2. 安装 Pipeline 框架

将 GradingPoolSeq pipeline 框架安装到你的系统中：

1. 下载框架文件
   假设你已经获得了 GradingPool_framework.tar.gz 文件，将其解压到工作目录中：

   cd /path/to/working/directory
   cp /path/to/GradingPool_framework.tar.gz .
   tar zxvf GradingPool_framework.tar.gz
   

2. 进入解压后的目录

   cd GradingPool_framework
   

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3. 准备数据

你需要准备以下数据：

• 参考基因组文件 (ref.fa)
• 每个批量的 Fastq 文件 或者
• 通过 SNP calling 得到的 VCF 文件（如果已经完成）

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4. 执行 Pipeline

根据你的数据情况，选择以下两种方式之一：

4.1 如果你没有 VCF 文件（从 Fastq 文件开始）

1. 建立参考基因组索引
   使用 BWA 建立参考基因组索引：

   bwa index ref.fa
   

2. 对每个样本的 Fastq 文件进行比对
   假设有 6 个批量（4 个 F2 代和 2 个亲本）：

   bwa mem -M -R "@RG\tID:Pool1\tSM:Pool1" ref.fa Pool1.fastq.gz > Pool1.sam
   bwa mem -M -R "@RG\tID:Pool2\tSM:Pool2" ref.fa Pool2.fastq.gz > Pool2.sam
   bwa mem -M -R "@RG\tID:Pool3\tSM:Pool3" ref.fa Pool3.fastq.gz > Pool3.sam
   bwa mem -M -R "@RG\tID:Pool4\tSM:Pool4" ref.fa Pool4.fastq.gz > Pool4.sam
   bwa mem -M -R "@RG\tID:Parent1\tSM:Parent1" ref.fa Parent1.fastq.gz > Parent1.sam
   bwa mem -M -R "@RG\tID:Parent2\tSM:Parent2" ref.fa Parent2.fastq.gz > Parent2.sam
   

3. 将 SAM 文件转换为 BAM 文件

   samtools sort -o Pool1.bam Pool1.sam
   samtools sort -o Pool2.bam Pool2.sam
   samtools sort -o Pool3.bam Pool3.sam
   samtools sort -o Pool4.bam Pool4.sam
   samtools sort -o Parent1.bam Parent1.sam
   samtools sort -o Parent2.bam Parent2.sam
   

4. 标记重复序列
   使用 Picard 工具标记重复序列：

   java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT=Pool1.bam OUTPUT=Pool1.dedup.bam METRICS_FILE=Pool1.metrics
   java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT=Pool2.bam OUTPUT=Pool2.dedup.bam METRICS_FILE=Pool2.metrics
   java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT=Pool3.bam OUTPUT=Pool3.dedup.bam METRICS_FILE=Pool3.metrics
   java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT=Pool4.bam OUTPUT=Pool4.dedup.bam METRICS_FILE=Pool4.metrics
   java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT=Parent1.bam OUTPUT=Parent1.dedup.bam METRICS_FILE=Parent1.metrics
   java -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT=Parent2.bam OUTPUT=Parent2.dedup.bam METRICS_FILE=Parent2.metrics
   

5. 索引 BAM 文件

   samtools index Pool1.dedup.bam
   samtools index Pool2.dedup.bam
   samtools index Pool3.dedup.bam
   samtools index Pool4.dedup.bam
   samtools index Parent1.dedup.bam
   samtools index Parent2.dedup.bam
   

6. 进行 SNP calling
   使用 GATK 的 HaplotypeCaller：

   java -jar gatk --java-options "-Xmx4g" HaplotypeCaller -R ref.fa -I Pool1.dedup.bam -I Pool2.dedup.bam -I Pool3.dedup.bam -I Pool4.dedup.bam -I Parent1.dedup.bam -I Parent2.dedup.bam -O Results.vcf
   

4.2 如果你已经有 VCF 文件

你可以跳过上述步骤，直接从 VCF 文件开始。

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5. 数据过滤

使用 Perl 脚本对 VCF 文件进行过滤：

1. 过滤低质量变异

   perl Filter_Quality.pl Results.vcf > filter1.txt 100
   

2. 选择合适深度的变异

   perl Filter_Depth.pl filter1.txt > filter2.txt 6 0.05 0.95
   

3. 筛选亲本中基因型不同的变异

   perl Filter_Parent.pl filter2.txt > filter3.txt 5 6
   

4. 过滤所有池中非参考碱基的 SNP

   perl Filter_SNP.pl filter3.txt > filter4.txt 6 1 2 3 4
   

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6. 计算 P 值

使用 Perl 脚本计算 P 值：

perl Ridit.pl filter4.txt > pvalue.txt 1 2 3 4

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7. 去噪策略

使用 Perl 脚本进行去噪：

perl denoise.pl pvalue.txt > ratio.txt 4 10 12

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8. 图形分析

使用 R 脚本生成图形：

1. 生成 P 值图

   Rscript pos-pvalue.R
   

2. 生成比例图

   Rscript pos-ratio.R
   

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9. 识别峰值区间

使用 Perl 脚本识别峰值区间：

perl p-max.pl ratio.txt 1

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10. 查看结果

• P 值图：查看 pvalue.png 文件。
• 比例图：查看 ratio.png 文件。
• 峰值区间：查看 p-max.pl 的输出。

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注意事项

1. 参数调整：根据你的数据和需求，可能需要调整脚本中的参数（如质量阈值、深度范围等）。
2. 脚本路径：确保所有脚本文件（如 Filter_Quality.pl、Ridit.pl 等）的路径正确。
3. 运行时间：整个流程可能需要较长时间，具体取决于数据量和计算资源。