MitoSOX Red 别名：Mitochondrial Superoxide Indicator； 红色线粒体超氧化物荧光探针
MitoSOX Red是一种广泛用于检测活细胞线粒体中超氧化物的荧光探针。它因其高特异性和灵敏度，成为氧化应激研究中的重要工具。下面为你详细介绍它的化学性质、工作原理、实验应用及注意事项。
化学性质
MitoSOX Red的主要化学特性如下：
- 分子式与分子量：分子式为 C₄₃H₄₃IN₃P，分子量约为 759.70 g/mol。
- CAS号：1003197-00-9。
- 纯度：99%
- 厂家：AbMole
- 外观与溶解性：常温下为黄色至棕色的固体粉末，能溶于DMSO（例如60-100 mg/mL），但在水中溶解度不佳。
- 荧光属性：最大激发/发射波长通常为 510/580 nm（红光）。此外，它还有另一个约 396 nm 的激发峰，据此发射波长约 610 nm，用此波长激发可能特异性更高。
- 化学结构：作为一种二氢乙啶（Hydroethidine）的阳离子衍生物，其结构连接了三苯基膦（TPP+） 基团，这有助于其靶向线粒体。
- 稳定性与储存：对光敏感，应在 -20°C 下避光、防潮、密闭保存。建议分装冻存，避免反复冻融。
原理机制
MitoSOX™ Red的检测机制精巧而特异，主要涉及两个关键步骤。首先，探针分子中带正电荷的三苯基膦（TPP⁺）基团使其能够轻易穿透细胞膜和线粒体膜，并利用线粒体膜内负外正的膜电位（ΔΨm）进行富集，从而特异性地靶向至线粒体基质中。其次，进入线粒体后，MitoSOX™ Red可被线粒体内部产生的超氧化物（O₂·⁻）特异性氧化。这一氧化反应具有高度选择性，探针不易被其他常见的活性氧（如过氧化氢）或活性氮物种氧化。氧化后的产物能够与线粒体或细胞核内的DNA紧密结合，一旦结合，便会产生强烈的红色荧光。荧光的强度与线粒体中超氧化物的水平成正比，因此可通过测量荧光强度来定量超氧化物的生成量。
实验应用
MitoSOX™ Red在生物医学研究领域具有广泛的应用。在检测方法上，它兼容多种荧光技术平台，包括荧光显微镜（特别是共聚焦显微镜）用于直接观察超氧化物在细胞内的定位与分布；流式细胞术用于快速、定量地分析大量细胞群体的线粒体超氧化物水平；以及荧光酶标仪用于进行高通量药物筛选。在研究内容上，该探针是探索氧化应激相关生理与病理过程的利器，常用于研究诸如神经退行性疾病、心血管疾病、代谢性疾病、癌症以及衰老等多种过程中线粒体功能障碍与氧化损伤的作用。此外，它也适用于更复杂的实验模型，如三维细胞培养物（类器官、细胞球），以在更接近体内的环境中评估氧化应激。
注意事项
在使用MitoSOX™ Red进行实验时，有几个关键点需要特别注意。其一，探针的装载浓度和孵育时间需要根据具体的细胞类型进行优化，浓度过高或时间过长可能导致非特异性信号或细胞毒性。其二，由于线粒体膜电位是探针靶向的基础，任何影响膜电位的因素都可能干扰探针的积累和荧光信号，因此需设置合适的对照以区分膜电位变化与超氧化物产生的真实变化。其三，实验操作全程应注意避光，以减轻探针的光漂白和光毒性。其四，为了确保信号的特异性，建议设置阳性对照（如使用Antimycin A诱导超氧化物产生）和阴性对照（如使用超氧化物歧化酶类似物，SOD-mimetic，来清除超氧化物）。最后，需要认识到氧化产物亦可被细胞内的酶进一步代谢，且其与DNA的结合是其高荧光产率的关键，在解释结果时应综合考虑这些因素。