SPR 实验笔记：从原理到实操，解锁天然产物筛选、靶点验证与膜蛋白互作的“金标准”技术
开篇：为什么 SPR 是科研人的 “分子天平”？
表面等离子体共振（SPR）技术凭啥能写入中美药典，成为生物分子互作研究的 “金标准”？答案藏在它的三个核心优势里：无标记干扰（避免荧光标记破坏分子活性）、实时动态监测（全程记录结合 - 解离全过程）、定量精度高（精准计算亲和力参数）。
更关键的是，它能解决科研中的三大痛点：从中药提取物里 “钓” 活性成分、验证药物与靶点的直接结合、破解膜蛋白与小分子的互作谜题。这篇笔记就带你吃透 SPR 的原理、实操和前沿应用。
5 分钟看懂 SPR 原理：光与金属的“互动游戏”
SPR 的核心是一场发生在芯片表面的光学魔术，关键流程可简化为 3 步：
1. 激发共振：偏振光以特定角度照射芯片表面的金 / 银纳米薄膜，激发自由电子形成 “表面等离子体波”，此时反射光强度骤降（形成共振角）。
2. 互作触发：将蛋白（配体）固定在薄膜上，当小分子（分析物）流经表面并结合时，薄膜附近折射率改变，共振角随之偏移。
3. 信号转化：偏移量被转化为 “响应单位（RU）”，1 RU≈1pg/mm² 的质量变化，最终生成实时结合 - 解离曲线。
【核心参数解读】
▶ 结合速率常数（ka）：分子“相遇结合”的快慢
▶ 解离速率常数（kd）：结合物“分手解离”的难易
▶ 平衡解离常数（KD=kd/ka）：亲和力指标，KD 越小结合越牢固
实操避坑指南：从芯片到数据的全流程攻略
SPR 实验想少走弯路？这份标准化流程 + 关键技巧请收好（结合 Springer Protocols 与 Thermo 技术手册整理）：
【芯片选择速查表（参考 IBA、Sigma 技术资料）】
▶ 常规互作：CM5 羧基芯片（通用型，适合蛋白固定）
▶ 低 NSB 需求：HLC 低电荷芯片（疏水 / 静电吸附少）
▶ 膜蛋白研究：定制脂质纳米盘修饰芯片（维持天然构象）
三大应用方向：SPR 如何解决科研关键问题？
1. 天然产物筛选：从复杂提取物到活性单体的“精准捕捞”
传统筛选靠“大海捞针”，SPR 实现“靶向垂钓”，核心流程为：“靶蛋白固定 → 提取物初筛 → 活性单体验证 → 结合动力学表征”。
【经典案例：飞燕草素降尿酸活性成分的筛选与验证】
1. 实验设计：以尿酸生成关键酶黄嘌呤氧化酶（XO）为靶蛋白，通过胺偶联法固定于CM5芯片，红腰豆提取物梯度稀释为分析物，设别嘌醇（阳性）及无活性黄酮（阴性）对照；
2. 筛选过程：SPR监测发现提取物中某组分与XO结合响应值（RU）显著高于阴性对照且呈浓度依赖性，经“SPR结合-质谱联用”鉴定为飞燕草素-3-葡萄糖苷（Dp-3G）；
3. 验证结果：Dp-3G与XO结合稳定（KD=0.32μM、kd=1.2×10-3s-1）；突变XO的FAD活性位点后结合信号降92%，证实其靶向该位点抑制活性，与酶活实验一致。
【核心价值：SPR实现“活性筛选-成分鉴定-靶点验证”一体化，较传统ELISA省去小分子标记，可区分“结合活性”与“抑制活性”，减少假阳性。】
2. 药物靶点验证与关键氨基酸位点解析：锁定互作的“分子钥匙”
SPR 是靶点验证的“最终判官”，常与 Pull-down、定点突变联用，核心逻辑为：初筛候选靶点 → SPR 验证直接结合 → 突变体定位关键位点。
【经典案例：GENI靶向AMPK的靶点验证及结合位点解析】
1. 靶点验证：经DARTS、CETSA初筛预测AMPK为栀子衍生物GENI潜在靶点后，SPR验证显示：AMPKα/γ二聚体与GENI直接结合（KD=1.07μM），亲和力优于阳性对照AICAR（KD=2.31μM）；
2. 关键位点定位：构建AMPK丙氨酸扫描突变体，SPR检测结合活性筛选关键结合位点；
3. 结论：AMPKα亚基Asp148、Asp157及γ亚基Lys148、Lys309为GENI结合关键位点，突变后结合活性丧失70%以上，为结构优化提供依据。
3. 膜蛋白-小分子互作：突破“固定即失活”的技术瓶颈
膜蛋白占人类蛋白的 1/3、药物靶点的 60%，但体外易失活、难纯化，互作研究受限。传统SPR固定（如物理吸附）易破坏构象，中科院团队开发的新技术完美解决这一问题。
【经典案例：膜蛋白SPR固定新策略及互作分析】
▶ 创新方案：将 SpyTag 融合到膜支架蛋白（MSP）上，与目标膜蛋白共组装成脂质纳米盘；芯片表面预先固定 SpyCatcher，通过两者共价结合实现膜蛋白的近生理环境固定。
▶ 应用效果：成功测定 3 类膜蛋白互作（蛋白 - 磷脂、跨膜蛋白 - 抗体、跨膜蛋白 - 小分子），获得高质量动力学数据，为 GPCR 等难研究膜蛋白的药物开发提供可能。
SPR 的进阶学习资源
结语
SPR技术绝非单纯的“检测工具”，而是贯穿药物研发全链条的“核心枢纽”——从天然产物中精准“钓取”活性单体（如Dp-3G），到锁定药物与靶点的关键互作位点（如GENI与AMPK的结合位点），再到打破膜蛋白研究的“固定即失活”瓶颈，它以“无标记干扰、实时动态追踪、定量精度可靠”的独特优势，让微观分子间的“隐秘互动”转化为清晰可辨的结合曲线。
对于科研人而言，掌握SPR不仅要吃透“共振原理”，更要深谙实操中的细节把控——从芯片选择的适配性到再生液的浓度调试，从数据拟合的模型选择到非特异性结合的抑制技巧，每一步都藏着提升实验效率的关键。希望小谱梳理的的这份应用案例与实操要点，能成为大家实验中的“避坑指南”。
若你在 SPR 实验中遇到过棘手的非特异性结合问题、膜蛋白固定难题，或是有独特的实验技巧想分享，欢迎在评论区留言交流！
主要参考资料
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