技术分享｜重组单克隆抗体制备全流程：从抗体发现到纳米抗体应用，关键步骤与优势解析
在生物医药研发中，重组单克隆抗体凭借 “序列可控、批间稳定、可灵活改造” 的核心优势，逐渐取代传统杂交瘤抗体，成为科研检测、临床诊断与治疗的核心工具。不同于依赖动物免疫的传统方法，重组抗体制备通过基因工程技术，实现了从 “抗体发现→载体构建→表达纯化” 的全流程可控，尤其在纳米抗体等新型抗体研发中展现出独特价值。本文将系统拆解重组单克隆抗体的制备流程，聚焦关键技术节点与纳米抗体的适配性，为相关研究提供实操参考。
一、重组单克隆抗体的核心优势：为何取代传统抗体？
相比传统单克隆抗体（杂交瘤技术制备）和多克隆抗体，重组单克隆抗体的优势体现在 “稳定性、灵活性、伦理合规性” 三大维度，完美适配现代生物医药需求：
- 长期稳定供应，批间差异小：重组抗体的编码基因可长期保存（如 - 80℃冻存质粒），避免传统杂交瘤细胞株 “染色体丢失、复苏后死亡” 的风险；且基因序列固定，不同批次表达的抗体性能一致性高（纯度、亲和力波动通常＜5%），尤其适合临床诊断试剂（需结果可重复）与治疗性抗体（需严格质量控制）；
- 可灵活基因改造，适配多元需求：通过基因编辑可实现多种修饰 —— 如制备抗体片段（Fab、scFv、纳米抗体）、进行人源化改造（降低免疫原性）、替换 Fc 段（调整效应功能）、构建双特异性抗体（同时识别两个靶点），甚至添加 His、HA 等标签便于纯化与检测；
- 无需依赖动物，伦理与效率兼顾：传统抗体制备需反复免疫动物，周期长（2-3 个月）且受动物个体差异影响；重组抗体可通过噬菌体库、单 B 细胞测序等无动物方法发现，且能在微生物或细胞中规模化表达，既符合动物伦理，又将制备周期缩短至 1-2 周（小试阶段）。
二、重组单克隆抗体制备全流程：七大关键步骤解析
重组单克隆抗体制备需经过 “抗体发现→基因测序→载体构建→细胞转染→抗体纯化→鉴定→规模化生产” 七大步骤，每个环节均需精准控制以确保抗体质量，其中纳米抗体在多个步骤中展现出适配优势：
1. 第一步：抗体发现 —— 三大主流技术，覆盖不同需求
抗体发现是制备的核心起点，需获取针对目标抗原的高特异性抗体基因，主流技术分为三类：
- 杂交瘤技术（传统与重组结合）：先通过免疫小鼠获取产生特异性抗体的 B 淋巴细胞，与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞；再从阳性杂交瘤细胞中提取 mRNA，反转录为 cDNA 后扩增抗体可变区基因 —— 该方法适合已有成熟杂交瘤细胞株的场景，可将传统抗体转化为重组抗体；
- 噬菌体展示技术（无动物依赖，适配纳米抗体）：将编码抗体片段（如 scFv、纳米抗体 VHH）的基因插入噬菌体外壳蛋白基因，使抗体片段展示在噬菌体表面；通过 “吸附 - 洗脱 - 扩增” 多轮筛选（如用抗原包被磁珠捕获特异噬菌体），最终测序获得抗体基因 —— 该方法无需免疫动物，且能高效筛选纳米抗体（VHH 基因片段小，易克隆入噬菌体载体），是纳米抗体制备的首选技术；
- 单 B 细胞测序技术（直接获取天然抗体基因）：从免疫动物或人体外周血中分离单个 B 细胞（通过流式细胞仪或微孔板分选），提取 mRNA 后通过 RT-PCR 扩增抗体轻重链基因；该方法能保留 B 细胞天然的抗体序列多样性，尤其适合获取全人源抗体基因，且可直接克隆纳米抗体的 VHH 基因。
2. 第二步：抗体基因测序 —— 确保序列准确性
从杂交瘤细胞、噬菌体或单 B 细胞中获取抗体基因后，需通过以下步骤确认序列：
- 提取 mRNA 并反转录为 cDNA；
- 用特异性引物 PCR 扩增抗体轻重链可变区（VH/VL）或全长基因（针对纳米抗体，仅需扩增 VHH 基因）；
- 将 PCR 产物克隆至测序载体，挑取阳性克隆进行 Sanger 测序，确保基因序列无突变、阅读框正确 —— 这一步是后续载体构建的基础，若序列错误会导致抗体表达失败或功能异常。
3. 第三步：载体构建 —— 根据抗体类型选择适配系统
载体构建需匹配抗体类型（全长抗体 / 纳米抗体）与后续表达宿主，核心是确保抗体基因高效、正确表达：
- 全长抗体（如 IgG）：优先选择哺乳动物细胞载体（如针对 CHO、HEK293 细胞的载体），需包含真核启动子（如 CMV 启动子）、信号肽（如 Igκ 信号肽，引导抗体分泌至培养基）、筛选标记（如潮霉素抗性基因），且载体需支持抗体轻重链共表达（如双启动子或 IRES 序列）；
- 纳米抗体（VHH）：载体选择更灵活 —— 原核载体（如 pET 系列）适合快速小试（大肠杆菌表达，1-2 天获得蛋白），酵母载体（如 pPICZα）适合规模化分泌表达（毕赤酵母可将纳米抗体分泌至培养基，纯化简便），哺乳动物载体则适合需 Fc 融合的纳米抗体（如增强 ADCC 效应的治疗性纳米抗体）。
4. 第四步：细胞转染表达 —— 平衡效率与抗体活性
将构建好的载体导入宿主细胞，根据需求选择瞬时转染（快速验证）或稳定细胞株构建（规模化生产）：
- 瞬时转染：适合抗体功能初步验证，常用 HEK293 细胞（转染效率高，1-3 天获得表达），采用 PEI 或脂质体（如 Lipofectamine 3000）转染，优化 DNA: 转染试剂比例（通常 1:2-1:3）与细胞密度（70%-80% 汇合度最佳）；纳米抗体因结构简单，在大肠杆菌中也可实现瞬时高效表达（IPTG 诱导 4-6 小时即可收获）；
- 稳定转染：适合规模化生产，常用 CHO 细胞（表达稳定、可实现人源糖基化），通过筛选标记（如嘌呤霉素）筛选单克隆细胞株，经扩大培养后可在生物反应器中量产（表达量可达 1-10g/L）—— 全长治疗性抗体多采用此方式，纳米抗体若需临床应用也可通过 CHO 细胞稳定表达。
5. 第五步：抗体纯化 —— 多步层析确保高纯度
抗体纯化的核心是去除杂蛋白、聚合体与内毒素，根据抗体类型选择适配方法：
- 预处理：收集细胞培养上清或细菌裂解液，通过离心（8000×g，10 分钟）、过滤（0.22μm 滤膜）去除细胞残渣；
- 亲和层析（核心步骤）：全长抗体用 Protein A/G 树脂（特异性结合 Fc 段），纳米抗体因无 Fc 段，需用 His 标签亲和层析（如 Ni-NTA 树脂）或抗原亲和层析，一步纯化可将纯度提升至 80% 以上；
- 精细纯化：通过离子交换层析（去除电荷差异杂蛋白）、凝胶过滤层析（去除聚合体），最终获得纯度≥95% 的抗体 —— 纳米抗体因分子量小（12-15kDa），凝胶过滤层析可有效分离单体与少量二聚体，确保活性。
6. 第六步：抗体鉴定 —— 多维度验证质量与功能
纯化后的抗体需通过以下检测确保符合应用需求：
- 纯度与分子量：SDS-PAGE（检测轻重链或纳米抗体条带是否单一）、SEC-HPLC（分析单体比例，需≥95%）、内毒素检测（治疗性抗体需＜1 EU/mg）；
- 免疫学活性：ELISA（检测抗体与抗原的结合特异性，计算 OD450 值与阴性对照比值，≥3 为阳性）、Western blot（验证抗体识别目标蛋白的能力）、SPR/BLI（定量亲和力，治疗性抗体需达 nM 级别，纳米抗体可至 pM 级别）；
- 细胞水平活性：流式细胞术（检测抗体与细胞表面抗原的结合）、功能实验（如中和实验、ADCC 效应检测，针对治疗性抗体）。
7. 第七步：规模化生产与应用
根据需求选择生产规模：小试（摇瓶培养，毫克级，用于科研检测）、中试（10-100L 生物反应器，克级，用于诊断试剂原料）、量产（1000L 以上，千克级，用于治疗性抗体）—— 纳米抗体因表达效率高（大肠杆菌量产可达 50-100mg/L，酵母可达 500mg/L），尤其适合诊断试剂、工业酶融合等大规模应用场景。
三、纳米抗体在重组抗体制备中的适配性：结构优势带来的流程简化
纳米抗体（VHH）作为重组抗体的重要亚型，凭借 “单域结构、小分子量” 的特点，在制备流程中展现出独特优势：
- 抗体发现阶段：VHH 基因片段小（约 360bp），易克隆入噬菌体载体，噬菌体库构建效率比全长抗体高 30%-50%；且纳米抗体可识别传统抗体难以接触的 “隐蔽表位”（如酶活性中心），筛选特异性更强；
- 表达阶段：无需糖基化修饰，可在大肠杆菌中高效可溶性表达（避免全长抗体的包涵体问题），且无需复杂的轻重链共表达调控，载体构建更简单；
- 纯化阶段：仅需一步 His 标签亲和层析即可获得高纯度，无需 Protein A/G 树脂（降低成本），且因无 Fc 段，避免了 Fc 介导的非特异性结合，后续精细纯化步骤可简化。
总结
重组单克隆抗体制备通过基因工程技术，实现了从抗体发现到应用的全流程可控，解决了传统抗体制备的稳定性与灵活性难题。其中，纳米抗体凭借结构优势进一步简化了制备流程，成为科研与产业应用的热门选择。随着基因编辑、AI 辅助设计等技术的融合，重组单克隆抗体（尤其是纳米抗体）将在精准医疗、新型诊断试剂研发中发挥更大作用。
泰克生物提供重组单克隆抗体制备全流程支持，涵盖噬菌体库构建、纳米抗体制备、载体构建与表达纯化，助力科研检测与生物医药研发高效推进。