【New Phytologist】单细胞多组学揭示根毛对盐胁迫的特异性响应文献分享
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写在前面文章
摘要
引言
结果1：结合snRNA-seq、snATAC-seq与Stereo-seq技术，构建了不结球白菜（NHCC）根尖的单细胞转录组图谱
结果2：不结球白菜（NHCC）根尖不同细胞类型对盐胁迫的特异性响应
结果3：盐胁迫改变了根毛的生理状态
结果4：非生物胁迫下根毛基因表达重构的进化保守性
结果5：盐胁迫通过抑制根毛发育阻碍铁吸收
讨论
写在前面
这篇文章首次构建了不结球白菜根尖在正常与盐胁迫条件下的高分辨率转录组与染色质可及性图谱，揭示了盐胁迫抑制根毛发育与铁吸收的关键机制，为耐盐育种提供了新靶点与理论依据。
文章链接：https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.70160
https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.70160
摘要
土壤盐渍化因环境恶化和不当耕作而加剧，是可持续农业面临的主要挑战。根系是植物感知和响应盐胁迫的主要器官。本研究利用单细胞测序技术，首次构建了不结球白菜（NHCC）正常和盐胁迫条件下根尖的单细胞转录组与染色质可及性图谱。研究发现，盐胁迫会干扰根毛的正常分化，使许多根毛停滞在未分化状态，从而阻碍应激响应基因的表达。跨物种分析表明，盐胁迫和渗透胁迫均会以类似方式抑制根毛的分化与伸长，导致根毛数量减少且功能异常。我们进一步发现高盐环境会影响根毛的铁运输。与盐胁迫响应相关的基因、细胞类型特异的转录调控网络以及细胞分化轨迹，均与铁运输过程密切相关。特别是金属转运基因BcIRT2的表达受到盐胁迫的显著影响。沉默BcIRT2会导致叶片黄化、盐敏感性增强，并降低不结球白菜根部的铁含量。本研究为理解植物应对盐胁迫的机制提供了重要见解，也为培育耐盐型不结球白菜及其他作物提供了有价值的信息。
引言
植物无法自主移动，自然会受到多种生物与非生物胁迫的影响，这些胁迫常常对植物的生长发育造成不利后果。气候变化、环境污染以及不合理的施肥方式，加剧了土壤盐碱化，导致全球可耕地面积不断减少。盐碱土壤不仅阻碍植物根系的生长，还抑制叶片的光合作用，引发严重的萎蔫、黄化甚至植株死亡。盐胁迫已成为影响全球农业与园艺作物产量和品质的最具破坏性的非生物因素之一，也是最突出的限制因子之一。
不结球白菜（NHCC，Brassica campestris（同义名 Brassica rapa）ssp. chinensis）是一种重要的叶菜类蔬菜，广泛种植于世界多个国家和地区。其甜嫩多汁、营养丰富的叶片是主要的食用器官。然而，不结球白菜的栽培与生产常面临高盐环境的威胁。通常，盐胁迫会导致种子萌发延迟且不均匀。高盐环境还会引起土壤高渗透压，限制根系的吸收能力与正常生长，进而导致叶片黄化、植株萎蔫以及产量大幅下降。然而，目前关于不结球白菜在盐胁迫下分子机制的研究仍较为有限。
传统的高通量测序技术往往难以检测不同细胞类型之间基因表达的差异，忽视了单个细胞的独特属性。此外，许多控制不同细胞类型发育的关键基因尚未被鉴定，我们对不同细胞类型在盐胁迫下转录调控网络（TRN）的响应机制也知之甚少。因此，揭示不结球白菜在盐胁迫下动态的、细胞类型特异的转录调控网络，不仅有助于我们从单细胞层面理解不结球白菜如何响应盐胁迫，还可能为培育耐盐型不结球白菜及其他作物提供新的育种策略。
根系在植物生长发育过程中负责吸收水分和矿质养分，起着至关重要的作用。同时，根系也是感知土壤盐分的第一道防线。在本研究中，我们利用单核多组学技术，绘制了盐胁迫下不结球白菜根尖细胞的分子图谱。通过Stereo-seq和RNA原位杂交技术，我们对根细胞类型进行了注释，并刻画了不结球白菜在单细胞水平上的基因转录与染色质状态图谱。基于单细胞基因调控网络（GRNs），我们鉴定出了多个与胁迫响应相关的细胞类型特异性调控因子。此外，跨物种的单细胞转录组分析还揭示了根毛在应对盐胁迫与渗透胁迫过程中的一些保守功能。
结果1：结合snRNA-seq、snATAC-seq与Stereo-seq技术，构建了不结球白菜（NHCC）根尖的单细胞转录组图谱
我们对在150 mM NaCl盐胁迫处理12小时（盐胁迫组）和正常生长条件（对照组）下采集的5毫米根尖分离的细胞核，分别进行了单核RNA测序（snRNA-seq）和单核染色质可及性测序（snATAC-seq）（图1a）；每个处理组均设置两个生物学重复（即在两次独立实验中培养的幼苗）。经过质量控制筛选后，共获得30,771个细胞核的snRNA-seq数据，平均每个细胞核检测到3,163个基因（表S3）。同时，共保留了24,671个细胞核的snATAC-seq数据，平均每个细胞核获得9,431个测序片段。
我们对snRNA-seq数据进行了UMAP降维分析，共鉴定出8种不同的细胞类型（图1b–d）。单细胞转录组数据显示，生物学重复与技术重复之间具有高度的一致性（图S1a、b）。尽管十字花科植物（如不结球白菜）的根细胞类型标记基因大多尚未明确，但不结球白菜与拟南芥（Arabidopsis thaliana）在十字花科中具有较高的同源性。因此，我们首先利用拟南芥中已深入研究的标记基因对不结球白菜的数据进行初步注释（图1e，图S2；表S4）。结果显示，拟南芥中多个已知细胞类型标记基因的同源基因在不结球白菜中也呈现出细胞类型特异性的表达模式。基于这些同源标记基因，我们成功注释了包括根毛、内皮层、表皮、分裂细胞、中柱和根冠等在内的细胞类型。
然而，我们也发现，某些根尖细胞类型在拟南芥与不结球白菜中的发育情况存在差异。例如，不结球白菜根尖中发育出3–4层皮层细胞（图S3），而拟南芥中仅形成一层。此外，拟南芥皮层细胞已知标记基因的同源基因在不结球白菜中并未表现出细胞类型特异性表达图S4）。因此，诸如皮层和根尖分生组织初始细胞等类型，无法单纯依靠拟南芥同源基因进行准确注释。
为解决这一问题并验证同源基因注释的准确性，我们利用Stereo-seq技术对正常生长条件下不结球白菜根尖的基因表达进行了空间捕获（图S5）。基于空间信息与组织学特征，我们将Stereo-seq数据划分为5个聚类，包括表皮、皮层、中柱和分生初始区等（图1f），并鉴定出若干潜在的标记基因。例如，我们发现LOC103858637特异性表达于皮层及少量分生初始细胞，LOC103858639特异性表达于皮层细胞，而LOC103249170与LOC103860386则特异性表达于中柱细胞（图1g）。
随后，我们将Stereo-seq中鉴定出的细胞特异性标记基因映射到单细胞数据中，并将基因按照与这些标记基因的关联性进行聚类（图1h）。此外，我们还通过RNA原位杂交技术验证了根尖中聚类特异性标记基因的表达情况（图S6）。通过定义新的细胞类型特异性标记基因，我们构建了一幅解剖学示意图，清晰展示了各注释细胞群及其在根尖中的空间分布，并成功构建了首张涵盖不结球白菜根尖所有主要细胞类型的单细胞转录组图谱（图1i）。
结果2：不结球白菜（NHCC）根尖不同细胞类型对盐胁迫的特异性响应
基于正常与盐胁迫条件下不结球白菜根尖构建的转录组图谱，我们分析了8种细胞类型中的差异表达基因（DEGs）（图2a、b）。研究发现，不同细胞类型中DEGs的数量存在显著差异；例如，与其它细胞类型相比，皮层、根毛、中柱和内皮层细胞中无论是上调还是下调的DEGs数量都较多（图2a、b）。值得注意的是，大多数DEGs具有细胞类型特异性，表明不同细胞类型对盐胁迫的响应各不相同。这一结果凸显了在单细胞水平开展转录组分析的重要性。
为深入了解各细胞类型在盐胁迫下的分子功能，我们对每个细胞簇中盐胁迫诱导上调的基因进行了GO功能富集分析（图2c；表S5）。结果显示，与“应对有毒物质”和“伤口响应”相关的基因在内皮层、表皮和根冠中显著富集，提示这些细胞类型能够更迅速地响应并适应盐胁迫。此外，我们在皮层、根毛和中柱中观察到“核糖体相关”通路的显著富集。核糖体是细胞内蛋白质合成的核心机器，这些区域中核糖体相关基因的上调表达表明，在盐胁迫下这些细胞的整体蛋白质翻译能力得到了增强（图2c）。在盐胁迫条件下，分生初始细胞中与根发育相关基因的表达受到抑制，根毛中与环境和非生物胁迫响应相关基因的表达降低，而皮层、中柱和内皮层细胞中与分解代谢过程相关基因的表达也出现下调（图2d）。
为了挖掘我们snRNA-seq数据在揭示盐胁迫特异性响应机制方面的价值，我们分析了已知与盐胁迫相关基因在不同细胞类型中的特异性表达变化。脱落酸（ABA）作为一种关键的胁迫响应激素，在植物抵御盐胁迫中发挥着不可或缺的作用。为此，我们绘制了ABA生物合成与转运相关基因的表达图谱（图2e；表S6）。中柱是植物激素信号传导的核心区域。与此一致，我们发现ZEP、AA03、ABCG25、NCED5、NCED3、ABI3和ABA3等基因在中柱中特异性高表达（图2e），且大多数在盐胁迫下被诱导表达。
与ABA类似，盐胁迫也能诱导植物体内乙烯的积累。相应地，乙烯生物合成相关基因在皮层、根冠、中柱和内皮层中特异性表达。例如，盐胁迫激活了中柱中ACS6、ACS2、ACO4和ACO5的表达，但在根冠、皮层和内皮层中这些基因的表达却被抑制。水杨酸（SA）在盐胁迫下可促进植物光合作用，也在植物耐盐性中发挥重要作用。然而，SA生物合成相关基因并未表现出显著的细胞类型特异性表达，且这些基因在盐胁迫前后的表达模式各异（图2e）。这些结果表明，ABA等植物激素在调控植物盐胁迫响应中具有时空特异性。
鉴于不同细胞类型在盐胁迫下表现出各异的响应模式（图2c、d），我们收集了在拟南芥中已被深入研究的盐胁迫相关基因的同源基因，并分析了它们在不结球白菜不同细胞类型中的表达模式（图2f；表S7）。由于芸薹属植物（如不结球白菜）在进化过程中经历了多次基因组复制与丢失事件，我们考察了多个同源基因的表达情况。值得注意的是，这些基因在盐胁迫组中呈现出细胞类型特异性的诱导表达。例如，WRKY46、MAPKKK18、OSCA1.3和ABI2等基因在盐胁迫后主要在根冠中被诱导表达。
先前的研究表明，HARDY基因的高表达可提高水稻和拟南芥的耐盐性。在本研究中，HARDY的两个同源基因（HARDY-1 和 HARDY-2）在不结球白菜的不同细胞类型中表达水平发生变化。其中，HARDY-1在盐胁迫后于分生初始细胞中高度诱导表达；HARDY-2在根冠和中柱细胞中表达较高，在根冠中进一步被诱导，但在中柱中表达受到抑制。
植物通过依赖于钙的蛋白激酶（如SOS途径）介导盐胁迫信号传导与钠离子耐受。我们的单细胞数据显示，SOS1基因特异性表达于皮层细胞，且在盐胁迫前后其表达水平均未发生显著变化（图2f）。AFP4/TMAC2是ABA与盐胁迫响应的重要负调控因子，在不结球白菜的分裂细胞、皮层、根毛及中柱细胞中均有表达，但在盐胁迫下其表达受到抑制。
结果3：盐胁迫改变了根毛的生理状态
盐胁迫可在植物中引发广泛的基因表达、代谢及生理性状响应。事实上，我们观察到盐胁迫对根尖中各类细胞类型的比例产生了显著影响，根毛细胞数量在盐胁迫条件下急剧减少（图3a，图S7a；表S8）。在根尖区域，盐胁迫显著抑制了根毛的长度与密度（图3b，图S7b–c），这与单核转录组测序数据中根毛细胞数量的减少相一致（图3a，图S7a）。此外，在盐胁迫下，成熟区的根毛密度与长度均有所下降，而分生区的根毛密度与长度反而有所增加（图S7d、e）。
根毛是由最外层表皮细胞特化发育而成的特殊结构，盐处理可改变拟南芥中无毛细胞（N细胞）与有毛细胞（H细胞）的空间分布。在不结球白菜（NHCC）的根尖中，最外层表皮由两个无毛细胞（与一个皮层细胞相邻，红色箭头所示）和一个有毛细胞（与两个皮层细胞相邻，黑色箭头所示）交替排列组成，与拟南芥类似。然而，在150 mM NaCl处理12小时后，无毛细胞与有毛细胞的空间排布并未发生显著变化（图S7f），这一点与拟南芥有所不同。此外，在盐胁迫组中，大多数有毛细胞也未形成明显的膨大结构（图S7f）。
鉴于盐胁迫对根毛表型产生了显著影响，且根毛相关响应基因在根毛细胞中显著减少（图2c、d），我们推测在盐胁迫条件下，根毛细胞的生理状态可能发生了重构，从正常的发育状态转变为胁迫诱导状态。为验证这一假设，我们尝试重建正常与盐胁迫条件下根毛细胞的发育轨迹。我们对已鉴定出的各细胞类型进行了伪时间分析，发现对照组与胁迫组的细胞在伪时间轨迹上具有相似的整体走向（图S8）。因此，我们重点关注盐胁迫下根毛细胞状态的重新编程，并展开更深入的分析。
考虑到根毛是由特化的表皮细胞发育而来，我们将表皮细胞也纳入伪时间分析，以重建根毛的发育过程（图3c–e，图S9）。根据伪时间轨迹，表皮细胞位于轨迹起始端，沿着轨迹逐步发育并分化为初生根毛。在分叉点之后，轨迹逐渐分化为两条分支：分支1与分支2，分别代表根毛的两种不同生理状态（图3c–e）。
在胁迫组中，分叉点之前的表皮细胞比例较高，而初生根毛细胞比例较低（图3e），由此我们推测盐胁迫可能抑制了从表皮向根毛的转化过程，从而导致根毛数量减少。为验证这一假设，我们重建了表皮细胞的发育轨迹（图S10a、b），并分析了对照组与胁迫组细胞在伪时间轨迹各阶段的细胞比例。结果显示，胁迫组中表皮细胞的比例沿伪时间发育轨迹逐渐下降（图S10c）。
已知根毛的发育过程包括四个阶段：细胞命运决定、起始、伸长与成熟。由于根毛的命运决定与起始与表皮的发育密切相关，我们在单细胞水平上检测了调控表皮–根毛发育的关键基因表达情况，发现与命运决定相关的基因（如GL2、EGL3 和 MYB66/WEREWOLF）在轨迹的早期与中期高度表达（图S10d），且在盐胁迫前后未发生显著变化（图S10e–g）。然而，与根毛起始相关的基因（如RHD6 和 RSL1）特异性表达于轨迹的后期（图S10d），并在盐胁迫下受到抑制（图S10h、i）。由此可见，盐胁迫影响了根毛的起始过程，从而导致不结球白菜中根毛数量的减少。
此外，对照组与胁迫组细胞在两条分支上的分布并不均衡。我们将分支1与分支2按伪时间顺序划分为四个阶段，并计算了各阶段中对照组与胁迫组根毛细胞的比例。在分支1中，胁迫条件下根毛细胞在早期占比约为25%，并随着发育逐渐下降；而在分支2中，这一比例逐渐上升，并在后期达到约25%，表明盐胁迫下根毛转录组发生了剧烈但异质性的重构（图3f，图S11）。
为挖掘可能介导根毛细胞状态转变的关键基因与通路，我们沿伪时间轨迹共鉴定出7,607个差异表达基因（DEGs）。这些基因聚类为5个具有不同表达模式的群组，反映了根毛发育过程中转录调控的重构程序（图3g；表S9）。其中，群组3的基因主要在分叉点之前（即表皮细胞阶段）高表达，这些基因富集于与细胞质翻译相关的GO条目。随后，群组4的基因在分支1与分支2的末端高表达，伴随与根毛分化相关基因（如RHS11、COBL9）的富集（图3g，图S12；表S9）。这些结果表明，分支2末端的细胞处于根毛分化阶段，而分支1末端的细胞则是分化末期的成熟细胞。
在分支1末端（胁迫组中根毛数量较少的区域），与细胞氧化应激解毒、伤口响应及硝酸盐转运（如MPK3、AZF3、CEK1）相关的基因（群组1与群组2）被诱导表达（表S9）。伪时间轨迹重建显示，根毛存在两种具有不同基因表达谱的生理状态：分别对应于成熟根毛（分支1）与正在分化的根毛（分支2）（图3g）。综合以上结果，我们得出结论：在盐胁迫下，根毛细胞的正常分化程序被扰乱，相当一部分根毛细胞停滞在未分化状态，从而阻碍了胁迫响应基因的表达。
结果4：非生物胁迫下根毛基因表达重构的进化保守性
为进一步解析盐胁迫下根毛的基因表达变化，我们利用表皮与根毛细胞的伪时间分析结果，将“初生根毛”定义为伪时间轨迹起始位置的起点（图S13a）。伪时间轨迹重建显示，胁迫组中的根毛细胞主要分布在轨迹的起始段与中段，而对照组的根毛细胞则均匀分布于整个轨迹中（图4a–c）。随后，我们沿伪时间顺序将发育轨迹划分为四个阶段，并计算了各组细胞在每个阶段中的比例。结果显示，胁迫组中的根毛在发育早期（约50%）比例很高，但在中、后期逐渐减少（图4d）。表型观察也显示，胁迫组根毛数量更少、长度更短。表皮细胞的伪时间轨迹进一步表明，盐胁迫抑制了根毛的起始过程。
在此基础上，我们进一步聚焦于盐胁迫对根毛伸长（即根毛发育起始后的阶段）的影响。我们沿根毛伪时间轨迹检测了参与根毛伸长过程的重要bHLH类转录因子的表达情况。有趣的是，这些基因主要在轨迹的中段表达（图S14a），且均受到盐胁迫的抑制（图S14b–e）。这些结果证实，盐胁迫通过抑制根毛的伸长，将不结球白菜（NHCC）的根毛细胞“锁定”在了未成熟状态。
基于盐胁迫可重塑根毛生理状态这一发现，我们进一步探究了该现象在不同非生物胁迫下是否具有进化保守性。为研究不同物种根毛在多种胁迫条件下保守基因的动态表达，我们将不结球白菜的数据与拟南芥在正常与渗透胁迫条件下培养的根尖单核转录组数据进行了对比分析。为确保跨物种分析的可靠性，我们在拟南芥与不结球白菜的数据中采用了相同的伪时间分析参数设置。
我们同样描绘了拟南芥根毛的发育轨迹，并将表皮细胞定义为伪时间轨迹的起始点（图S13b）。在靠近起始点的位置，渗透胁迫组与对照组沿相同轨迹发展，但在分叉点1处分化为两条分支：分支1与分支2（图4e–g）。渗透胁迫对分支1细胞无明显影响，但抑制了分支2细胞的发育（图S15）。对照组与渗透胁迫组在各个伪时间点上的细胞比例分布情况与不结球白菜的结果相似（图4d、h）。
为进一步确定非生物胁迫下根毛基因表达变化的进化保守性，我们筛选出在伪时间进程中呈现依赖性变化、且在物种间共表达的正交同源基因，并对每种表达模式进行了功能富集分析（图4i；表S10）。富集分析表明，在曲线起始阶段，与细胞生长、糖蛋白代谢过程及碳水化合物生物合成过程相关的基因在拟南芥与不结球白菜细胞中均高表达，且主要富集于初生根毛细胞中。群组2的基因在轨迹曲线中段被诱导表达，这些基因参与细胞成熟与根毛细胞（trichoblast）的成熟过程。值得注意的是，胁迫相关细胞的比例在中期逐渐减少（图4d、h），提示不同胁迫因子对十字花科植物根毛的共同影响是抑制根毛从分化向成熟状态的转变。
位于轨迹末端的细胞为成熟根毛，与茉莉酸响应、伤口响应相关的基因（群组3，如PP2CG1、SAP9、MYBR1、DEAR1、MPK3、MYC2 和 WRKY33）在这些细胞中被特异性诱导表达，暗示了成熟根毛在环境响应中的功能角色（图4i）。然而，在各种非生物胁迫下，成熟根毛的比例均有所下降（图4d、h），从而影响了拟南芥与不结球白菜根毛的环境响应能力。
此外，离子吸收是根毛的重要生理功能之一。与铁转运及铁稳态相关的基因（如IRT2 和 IREG3）也在群组3中高表达，但在两种物种的胁迫根毛中表达均显著降低（图4i），提示盐胁迫等非生物胁迫还可能通过抑制铁吸收相关功能，进一步削弱根毛的生理作用。
结果5：盐胁迫通过抑制根毛发育阻碍铁吸收
植物在长期进化中形成了相互关联的调控网络，使其能够快速适应环境变化，而单细胞测序技术帮助我们发现了不同细胞类型之间调控网络的差异。为探究细胞类型特异性的调控网络，我们首次在基因组尺度上将基因转录与动态开放的染色质区域（ACRs）相关联。首先，我们利用单细胞核ATAC测序（snATAC-seq）在不结球白菜（NHCC）根尖中绘制了单细胞水平的染色质开放区域，并根据染色质的开放程度对细胞进行聚类，进而将其与snRNA-seq数据进行关联分析（图S16）。总共获得了七个具有良好注释和相关性的细胞群。大部分细胞类型中，snRNA与snATAC数据之间表现出高度相关性（图S16g），但在分生初始细胞和表皮细胞中，转录水平与染色质开放度之间的相关性较低，提示转录后调控等其他因素可能也参与了基因表达的调节。
为系统揭示细胞类型特异性的调控网络，我们基于共表达与转录因子结合基序富集，利用SCENIC方法识别了以转录因子（TF）为核心的调控子（regulon）。最终，我们在八种细胞类型中共鉴定出169个TF调控子，图5(a)展示了每个细胞群中排名前十的代表性TF。热图分析显示，每个细胞群中调控子活性与对应TF的表达水平高度相关（图5b，图S17）。
鉴于盐胁迫对根毛发育具有显著影响，我们重点分析了排名前十的根毛特异性TF网络（图5c）。其中，转录因子BcRAP2.11（LOC103845724）与下游靶基因表现出强相关性。通过UMAP可视化发现，BcRAP2.11及其调控子特异性表达于根毛细胞中，并在盐胁迫下受到抑制（图5d–f）。我们进一步分析了对照组与胁迫条件下BcRAP2.11下游靶基因的表达情况，发现其中三个靶基因的表达显著被抑制，其余基因则无明显变化（图5g）。其中，LOC103861180（即BcIRT2，拟南芥IRT2的同源基因）为根毛特异性表达基因（图5h）。我们还发现，LOC103861180在对照根毛中的染色质开放峰数量高于盐胁迫根毛（图5i）。
有趣的是，我们的伪时间分析也显示，IRT2在拟南芥与不结球白菜的根毛成熟阶段均被诱导表达（图4i）。无论是伪时间分析（图4i）还是细胞类型特异性调控网络（图5c）均表明，盐胁迫抑制了根毛中铁转运相关基因的表达。BcIRT2在拟南芥与不结球白菜中均受到盐胁迫的显著抑制（图4i），并受到根毛特异性转录因子RAP2.11的调控。
为进一步探究缺铁对盐胁迫诱导叶片卷曲与黄化的影响，我们利用基于芜菁黄花叶病毒的VIGS（病毒诱导基因沉默）系统（pTY），在不结球白菜中沉默了BcIRT2基因。在pTY与pTY/BcIRT2处理10天后，通过RT-qPCR检测BcIRT2的表达情况，结果显示叶片中几乎检测不到BcIRT2表达，而根中经pTY/BcIRT2处理的植株其BcIRT2转录水平也显著下降（图S18a）。在正常条件下，BcIRT2-沉默植株（#1、#2、#3）表现出与盐胁迫下pTY处理植株相似的叶片黄化表型（图6a，图S18b）。
为进一步研究BcIRT2在不结球白菜中的功能，我们采用Perls染色法对正常培养条件下pTY与BcIRT2-沉默植株的根尖进行铁含量检测。结果显示，在正常条件下，BcIRT2-沉默植株根尖的铁含量低于pTY处理植株（图6b，图S18c）。此外，我们还通过Perls/DAB染色法评估了叶片中的铁含量。该方法通过DAB显色增强Perls染色检测叶片中铁（Fe）的灵敏度与精确度。结果显示，BcIRT2-沉默植株叶片中的铁含量也低于pTY处理植株（图6c）。这些结果说明，BcIRT2在不结球白菜根毛铁离子吸收中发挥重要作用（图6a–c）。
此外，BcIRT2-沉默植株（#4、#5、#6）在盐胁迫条件下比pTY处理植株表现出更严重的叶片卷曲与黄化（图6a），且BcIRT2的沉默导致不结球白菜对盐胁迫的敏感性增强。盐胁迫后，pTY与BcIRT2-沉默植株的叶片与根毛中铁含量均下降（图6b、c），且在胁迫条件下，pTY与BcIRT2-沉默植株间的铁含量与根毛长度均无显著差异（图6c，图S18d）。
我们进一步分析了pTY与BcIRT2-沉默植株中与盐胁迫相关基因的表达情况。选取了多个已知在盐响应通路中起关键调控作用的基因，包括ABA INSENSITIVE 5 (ABI5)、ABA INSENSITIVE 2 (ABI2)、MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN KINASE KINASE KINASE 18 (MAPKKK18)、SnRK2.7、ABA-INSENSITIVE PROTEIN KINASE 1 (MKKK20) 和 ABA REPRESSOR 1 (ABR1)，并在两类植株中进行检测（图6d）。结果显示，盐胁迫后，BcIRT2-沉默根中这些基因的表达水平显著高于pTY根，说明BcIRT2的沉默使不结球白菜对盐胁迫更加敏感，与表型观察结果一致。在叶片中，BcMAPKKK18在胁迫后表达无显著差异，但在pTY叶片中其表达受到抑制。不结球白菜中存在两个ABR1同源基因，盐胁迫下，BcABR1-1/-2在BcIRT2-沉默的叶片、根以及pTY根中均被诱导表达，而在pTY叶片中几乎检测不到表达。这些结果表明，不同组织在盐胁迫下的信号响应机制存在差异。
综上所述，本研究揭示了盐胁迫通过抑制根毛发育，进而抑制BcIRT2的表达（图4i），导致根部铁吸收能力下降，进而引发地上部分如叶片黄化等异常生理反应（图6）。
讨论
全面理解植物对胁迫的响应机制，对于精准育种具有至关重要的意义。单细胞/单核技术的应用，使我们能够以细胞类型特异性的方式探索转录组与染色质可及性的变化，从而揭示植物响应胁迫的分子与细胞机制。在本研究中，我们对正常与盐胁迫条件下不结球白菜（NHCC）根尖的30,771个细胞核进行了单细胞转录组测序，对24,671个细胞核进行了染色质可及性分析，并整合空间转录组数据和原位杂交实验，对细胞类型进行了注释。我们鉴定出了一系列新的细胞类型特异性标记基因，弥补了NHCC多数细胞类型缺乏特异性标记基因的研究空白，为深入研究NHCC根系发育的功能机制奠定了基础。
作为植物吸收水分与养分的主要组织，根尖通过与生物和非生物微环境互作，主要通过根毛细胞调控整株植物的生理功能。借助单细胞转录组图谱，我们系统描述了盐胁迫条件下根尖细胞在细胞与基因两个层面上所发生的变化，从而更全面地揭示了植物对盐胁迫的响应机制。通过根毛特异性调控网络与伪时间分析，我们发现盐胁迫影响了NHCC中与铁吸收相关基因的表达（图4i，图5c–i）。鉴于铁作为植物必需的微量元素，在呼吸电子传递链、光合作用以及氧化还原反应等多种关键代谢过程中作为辅因子发挥重要作用，我们进一步探究了盐胁迫对NHCC根系铁吸收的影响。病毒诱导基因沉默（VIGS）实验与Perls染色结果表明，盐胁迫抑制了成熟根毛的发育，显著削弱了其生理功能，尤其是铁吸收能力。BcIRT2基因沉默植株的铁含量显著降低，且对盐胁迫的敏感性显著增强（图6a–c），与我们的单细胞分析结果一致。这些发现揭示了盐胁迫与植物铁稳态之间重要的调控关系，为培育耐盐型不结球白菜提供了全新视角。
非生物胁迫会影响植物生理的多个方面，并引发发育过程的广泛变化。其中一些变化属于非适应性响应，反映了胁迫因子造成的损伤，例如高温胁迫引起的膜流动性与蛋白质结构的破坏。本研究结果支持盐胁迫下根毛发育属于一种非适应性响应，其重要生理功能（如离子吸收和环境响应能力）显著受损。这一现象较为普遍，因为我们在拟南芥渗透胁迫下的根毛发育分析中也观察到了类似结果（图4i）。我们的研究不仅为进一步探究NHCC根系发育奠定了基础，也提示未来在开展非生物胁迫相关育种计划时，应充分考虑根毛形态的可塑性。
作为首个针对NHCC根尖开展的单细胞多组学研究，本研究也存在一定局限性。首先，根尖结构高度复杂，即便在同一细胞类型（如根毛细胞）内部也存在显著的异质性。尽管盐胁迫总体上导致根毛密度与长度下降，但我们发现分生区根毛的长度与密度反而有所增加（图S7）。由于根毛细胞数量有限，限制了我们对这种异质性进行更深入的分析。一项针对油菜（Brassica napus）的研究发现，在萌发后55天施加100 mM NaCl会导致一级与二级侧根中根毛的密度与数量增加，表明成熟植株根系对盐胁迫的响应模式与幼苗阶段存在差异。未来研究若能获取更多具有空间与发育信息的细胞数据，将有助于更全面地揭示这种异质性。
其次，本研究的调控分析基于同一遗传背景的材料，未来若能在遗传多样性材料中进行群体水平的基因调控分析，将有助于揭示调控NHCC关键基因表达的遗传变异，为深入理解基因调控的遗传基础提供更广阔的视野。