生信分析之流式数据分析：Flowjo 软件核心功能全解析
流式细胞技术（Flow CytoMetry，FCM），是依托流式细胞仪，融合单克隆抗体、免疫细胞化学、激光及电子计算机科学等成果，开展单细胞定量分析与分选的技术 。其原理是在细胞分子层面，借单克隆抗体对单个细胞 / 生物粒子，做多参数、快速定量剖析，能秒分析数万细胞，还可同时测单个细胞多个参数，凭速度快、精度高、准确性好，稳居当代顶尖细胞定量分析技术之列。
目前用的较多的软件当属 Flowjo 。它能绘精美数据图，功能丰富，涵盖流式数据手工圈门、自动算补偿矩阵等常规分析。
下文就详细讲讲 Flowjo 软件的功能与插件，教你玩转流式数据处理！
一、Flowjo 的核心功能
1、数据导入与组织
FlowJo 有直观工作区，专用于组织、管理流式细胞数据。用户导入 FCS 格式文件超轻松，还能建工作区存分析流程。
操作：打开软件点 “Add Samples...” 选数据导入；或直接拖单个文件 / 文件夹进软件，效果一样。
2、数据可视化
FlowJo 支持直方图、散点图、双染色图等多种可视化图形 。用户可调坐标轴、变轴缩放提取信息，还能做门控操作。
操作：双击导入数据文件，生成 FSC - SSC 图；点横纵轴 “T” 选 “Customize Axis...”，改 “Scale” 数字，就能调整图形坐标。
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3、荧光补偿
多色流式实验里，不同荧光标记发射光谱易重叠，一个通道信号会混入其他通道干扰结果 。FlowJo 的补偿功能超强大，能校正荧光溢出，支持用内置补偿矩阵或手动调参数。
操作：
- 自动补偿：导入样本到 FlowJo，把单染管拖进 Compensation 组；选中该组，点菜单栏彩虹补偿；新补偿界面里，参数、样本、补偿名称、阴 / 阳性对照得一一对应，不对就调整；点 AutoSpill/AutoSpread，再点 View Matrix，自动补偿矩阵到手。
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- 手动补偿：导入样本后，选中单染样品管白框，双击打开；单击 “+” 加需补偿通道；按住 [M] 拖进 experiment，在补偿矩阵表格输数值，完成调整。
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4、细胞周期与增殖分析
FlowJo 为细胞周期和增殖分析配备了全套工具，把从数据导入到结果导出的流程都简化啦！靠强大的门控和模型拟合功能，用户能高效完成复杂生物学分析，还能导出高质量结果，用于后续研究或报告～
- 细胞周期：先把样本导入 Flowjo ，将横纵坐标设为 FSC 和 SSC ，圈选活细胞；接着双击打开 cells 选项，把横纵坐标改成 PI（A）和 PI（H），圈出单细胞；选中 single cell 选项后，在 Flowjo 的 tools 界面点 cell cycle ，再把横坐标设为 PI（A），软件就会自动计算啦。
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- 细胞增殖：导入样本到 Flowjo ，调整横纵坐标为 FSC 和 SSC ，圈选活细胞；双击打开 cells ，将横纵坐标设为 FSC（A）和 FSC（H）或者 FSC（A）和 FSC（W），圈出单细胞；选中 single cell 选项，在 Flowjo 的 tools 界面点 Proliferation Modeling ，把横坐标参数改成实验用的荧光通道，用未刺激的对照样本确定原代细胞（Generation 0）的荧光强度峰值；根据实验观察到的分裂代数，设置增殖峰数量；调整 Ratio（子代荧光强度与母代的比率）和 CV（变异系数）优化拟合结果，软件会自动算出增殖指数（Proliferation Index），也就是增殖细胞占总细胞的比例。
二、Flowjo 的插件：数据分析师的 “超能力加持”
1. 数据处理基石：给数据 “瘦身”
FlowAI
FlowAI 是个智能分析工具，能用机器学习算法自动识别、标注细胞群体，省掉人工操作的麻烦，让分析又快又准！还能自动识别并剔除碎片、粘连细胞、死细胞，就算样本被污染也能救回来～导入数据后，右键样本选 “FlowAI” ，设好阈值就会自动生成质控报告。
图 1 展示了用 FlowAI 工具对流式细胞术数据做质量控制和清理的结果。FlowAI 是自动化工具，专门去除流式细胞术数据里采集相关的异常事件，保证数据准确可靠。图 1 有三个部分（a、b、c），分别展示 FlowAI 的控制面板、输出结果，还有数据清理后的可视化报告。
Downsample
Downsample 插件能平衡不同样本间的细胞数量，让分析更公平合理！它可以随机抽取细胞，把不同样本的细胞数量降到同一数量级，消除样本大小差异带来的偏差。选中样本，点击 Downsample 插件，在弹出对话框点 Yes ，选一个样本当参考，插件就会对其他样本降采样。
2. 降维插件：高维数据的 “可视化魔法”
t - SNE：让细胞亚群 “浮出水面”
t - SNE 脱胎于 SNE（Stochastic Neighbor Embedding ，SNE；Hinton and Roweis, 2002 ），是机器学习算法家族的一员。它能把复杂的高维数据，巧妙投射到二维或三维空间，用 “彩色泡泡” 直观呈现细胞亚群分布格局，帮你轻松看穿细胞群体的聚类模式 。操作超简单：在 Flowjo 找到 t - SNE 插件，选定数据集，设置困惑度、迭代次数等降维参数，插件就会启动 “降维魔法”。
举个科研实例 ：斯坦福大学 2019 年《Nature》研究里，团队用单细胞转录组测序（10x Genomics 平台）剖析年轻与老年小鼠大脑神经发生微环境的细胞类型差异，聚焦衰老时 T 细胞浸润对神经干细胞增殖的影响，借助 t - SNE 算法做单细胞数据聚类可视化。结果超清晰 ：侧脑室脑下区（SVZ）有 11 类细胞（图 2a ），老年小鼠 SVZ 区域出现 T 细胞聚类（图 2b ），且年老小鼠神经干细胞（NSC lineage ）数量远低于年轻小鼠，细胞分布差异一目了然！
UMAP：更快更优的降维 “新势力”
UMAP 由 McInnes 等人研发，虽输出效果和 t - SNE 有相似处，但运算速度大幅提升，还能在局部与全局结构平衡间做到更好，结果展示也更通俗易懂 。使用时，在 FlowJo 工作区右键选目标细胞群，点 “Plugins” 里的 “UMAP 降维插件”，弹出窗口配置参数（像 Input Parameters 里的 number of neighbors、minimum distance、number of components 等 ），点击 “run”，就能得到降维后的数据。
看前沿研究案例 ：新加坡免疫学网络（SigN）2024 年《Science》研究中，对比两个中性粒细胞簇表面标记物表达，发现 T3 中性粒细胞有独特免疫调节特征，和肿瘤促肿瘤功能相关 。研究用 LEGENDScreen 试剂盒对肿瘤单细胞悬液做高参数流式检测（n = 10 ），补偿后分析活 CD45 + 细胞并导出用于 InfinityFlow 分析。UMAP 投影（图 3A ）清晰呈现胰腺肿瘤里两个中性粒细胞簇，Ly6G 表达强度红高蓝低；图 3B 显示簇 2 比簇 1 高表达 dcTRAIL - R1、PD - L1 等免疫抑制 / 调节表面标记，降维可视化助力精准解析细胞功能差异！
3. 聚类插件：AI 圈门神器，告别手动分拣时代
FlowSOM：细胞亚群的智能 “拼图大师”
FlowSOM 作为聚类分析与可视化利器，专治高维数据混乱难题✨。它如同拼图游戏般，能将表型相似的细胞自动归类成团，生成清晰的亚群图谱，并通过热图等形式立体呈现各亚群标记物表达特征。安装后在 Flowjo 的 Plugins 菜单即可唤醒，操作时右键选中目标细胞群，点击 “FlowSOM” 插件，设置 SOM Grid Size、Metaclusters 数量等参数后启动，AI 便会自动完成细胞群落的智能分拣。
如图 4 所示，通过 SPADE 与 FlowSOM 的树结构可视化对比，能直观看到两种算法的差异：SPADE 以层级树状图展现细胞群体的进化关系，而 FlowSOM 结合星形图，可同时呈现多标记表达特征，如同给细胞亚群加上 “身份标签卡”，让复杂的细胞网络瞬间清晰可辨。
Phenograph：用图论揭开细胞社群的 “社交密码”
Phenograph 是依托图论原理的聚类算法，能像绘制社交网络一样，将单细胞数据转化为细胞相似性网络，通过社区检测算法精准划分不同表型的细胞亚群。在 Flowjo 中使用时，右键选中细胞群进入插件设置界面，调整 k 近邻数、距离度量等核心参数后，即可启动 “细胞社群分析”。
看 2015 年哥伦比亚大学在《Cell》的经典研究：团队用 Phenograph 解析急性髓系白血病（AML）细胞异质性时，先将单细胞数据构建为 “细胞社交图”（图 5B），每个细胞是节点，边代表相似性，再通过社区检测识别出与预后相关的祖细胞样亚群。图 5C 中，红色标记的造血干细胞亚群（HSPCs）呈现 CD34+/CD45low 特征，且每个 Phenograph 亚群包含所有实验条件下的细胞，为 224 种信号响应分析搭建了精准的细胞分类框架，堪称肿瘤异质性研究的 “透视镜”！
X-shift：密度驱动的细胞聚类 “勘探仪”
X-shift 插件采用密度聚类算法，如同地质勘探般智能识别相似细胞群体，尤其擅长处理密度分布不均的数据。在 Flowjo 中右键选中目标细胞群，启用 X-shift 插件后，设置邻域距离、最小细胞数等参数，即可启动 “细胞密度测绘”。
该算法为小鼠造血分化研究揭开新维度：通过 Divisive Marker Tree（DMT）与单细胞力导向布局，不仅能锁定已知细胞群，更能挖掘潜在新亚群。如图 6（A）以树状图呈现细胞层级分类，节点半径与细胞数量立方根正相关，标记物截断值清晰标注各分支特征；图 6（B）显示 X-shift 在手工圈门群体中发现的新亚群；图 6（C）的骨髓样本力导向图中，颜色代表聚类结果，灰色框定位手工圈门区域，细胞按祖细胞（MPP）到各造血谱系的发育轨迹形成层次网络；图 6（D）与（E）分别展示单核细胞和 pDC 发育路径，标记物表达水平以色彩梯度呈现，精准定位经典 / 非经典单核细胞分支点及 pDC 从 CLP 分化的独特 MHCII + 浆细胞亚群。
4. 注释神器：细胞亚群的 “命名百科全书”
ClusterExplorer：聚类结果的 “可视化翻译官”
ClusterExplorer 插件堪称聚类分析的多语种翻译器，能一键生成折线图、热图等多元可视化图表，并在降维图上标注聚类分布区域。完成样本降维聚类后，启用该插件可自动定义细胞群并挖掘数据特征，其生成的图表如同给细胞亚群配上 “身份铭牌”，清晰展现各聚类的表型特征与空间分布。目前该插件适配 FlowSOM、Phenograph、X-shift 三种聚类算法，实现跨算法的结果整合与可视化。
MEM（Marker Enrichment Modeling）：标记物驱动的 “细胞命名引擎”
MEM 插件如同细胞命名的智能引擎，通过数据驱动的方式为细胞群生成客观标签。它通过比对参考群体，对高表达标记物进行评分排序，从富集度最高到最低生成标记物列表，为细胞群提供量化命名依据。
图 7 展示 MEM 如何通过蛋白质富集度量化实现细胞身份标注：图（a）将正常人类血液细胞经 viSNE 分析与 25D 质谱流式数据审核，划分为七个经典群体；图（b）生成的 MEM 标签热图显示各亚群标记物富集值与中位表达值，下方变异系数图区分表达均匀（如 CD45）与不均匀（如 CD8a）的标记物；图（c）对比发现，基于 MEM 值排除标记物时，k-means 聚类的 F-measure（聚类准确性）下降幅度显著大于随机排除，验证了 MEM 在细胞身份识别中的优越性。
5、CBA 插件：细胞因子检测的 “智能分析师”
CBA（Cytometric Bead Array）插件是流式数据领域的细胞因子分析利器，聚焦多因子检测场景，可自动生成标准曲线模型、精准计算因子浓度，同时兼容多因子协同检测。安装后在 Flowjo 中选中样本激活插件界面，将数据划分为样本组与标准组，完成微球群体定位、目标细胞因子勾选及圈门信息确认，最后输入标准曲线浓度参数，插件即能同步输出标准曲线与样本浓度值，全流程高效便捷。
如图 8 所示，FlowJo® CBA 插件支持多因子回归分析结果同屏展示，在单张图表中融合预测曲线、标准曲线与样本检测值，形成三维度综合分析视图。
总结：
FlowJo 依托多元化功能模块与插件体系，为流式细胞数据分析构建了全链条解决方案。从基础的数据可视化与门控分析，到高维数据的聚类降维与比较挖掘，均能精准契合科研工作者的实际分析需求。通过灵活调用各类插件，研究者可高效解析数据隐含信息，为免疫学、肿瘤学等领域的前沿研究赋予强劲的科研支撑，成为现代流式分析场景中不可或缺的核心工具。
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