主流邻近标记技术解析与应用

蛋白质是生命活动的直接执行者和体现者，其功能往往通过与其他蛋白质形成复杂的相互作用网络（Protein-Protein Interactions, PPIs）来实现。这些互作网络调控着细胞信号传导、代谢途径、基因表达调控、细胞骨架组装等几乎所有的生命过程。因此，深入研究PPI对于理解细胞功能、揭示疾病机制以及开发新的治疗策略至关重要。

邻近标记（Proximity Labeling, PL）技术的出现为PPI研究提供了更强大的方法，它能够在活细胞内原位、高效地捕捉到目标蛋白（Protein of Interest, POI）周围的邻居分子。通过将一个特殊的标记酶与POI融合表达，该酶能催化产生短寿命的活性标记物，共价修饰邻近的生物大分子。这些被标记的分子随后被富集和鉴定，从而揭示POI所处的微环境、互作网络以及其在特定亚细胞结构的定位。本文将聚焦于几种主流的邻近标记技术，包括BioID、TurboID和APEX及其衍生技术，剖析它们的原理、操作流程、应用领域及各自的优劣势，旨在提供一份实用的选择与应用指南。

一、邻近标记技术的基本原理

邻近标记技术通过基因工程手段，将一个具有催化标记能力的酶与研究者感兴趣的诱饵蛋白融合表达。当细胞内存在合适的底物时，标记酶会将该底物转化为一种高度活泼但不稳定的小分子标记物。这些活性标记分子寿命极短，只能在其产生位点周围极小的扩散半径内与邻近的内源性生物大分子发生共价连接反应。完成标记后，细胞被裂解，带有标记物的分子可以通过高亲和力的捕获手段进行富集。最后，利用高灵敏度的质谱技术对富集到的蛋白质进行鉴定和定量，从而绘制出POI在特定时间和空间下的邻近蛋白质组图谱。

根据标记反应的激活方式，邻近标记技术主要可分为两大类：

1.依赖过氧化氢（H₂O₂）激活：以抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase, APEX）及其衍生物（如APEX2）为代表。这类酶在H₂O₂存在的情况下，催化底物产生高活性的自由基进行标记。其特点是反应速度极快，时空分辨率高。但H₂O₂对细胞具有潜在的氧化损伤和毒性，需要精确控制其浓度和作用时间。

2.不依赖过氧化氢激活：主要包括基于生物素连接酶的技术，如BioID（Biotin Identification）及其衍生物（如BioID2, TurboID, miniTurbo, AirID）。这类技术通常直接利用细胞内源性或外源添加的生物素作为标记物。其操作相对温和，对细胞生理状态干扰较小。但部分早期技术标记时间较长，而一些高活性酶若控制不当也可能产生较高的背景。

二、主流邻近标记技术

1.BioID及其衍生技术

BioID (Biotin Identification) 是最早被广泛应用的依赖生物素连接酶的邻近标记技术之一，由Roux等人在2012年开发，为研究稳定蛋白质相互作用和亚细胞蛋白质组提供了有力工具。BioID技术基于大肠杆菌生物素连接酶BirA的一个突变体BirA*。野生型BirA能高效催化生物素与ATP反应生成生物素酰-5'-AMP，并将其特异性地连接到其天然底物——生物素羧基载体蛋白（BCCP）的特定赖氨酸残基上。R118G突变显著降低了BirA*对生物素酰-5'-AMP的亲和力，导致这个活性的中间产物在被BirA*稳定结合并传递给BCCP之前，有足够的时间从酶的活性位点扩散出来。一旦扩散出来，这个活泼的生物素酰-5'-AMP便会非特异性地与附近蛋白质表面暴露的赖氨酸残基发生反应，形成稳定的酰胺键，从而将生物素标记到这些邻近蛋白上。

优劣势分析

• 优势：

（1）技术相对成熟，已有大量文献报道和应用实例，操作流程标准化。

（2）操作相对简单，无需添加H₂O₂等对细胞有潜在毒性的试剂，对细胞生理状态干扰较小。

（3）标记产物（生物素化蛋白）非常稳定，能够耐受严格的洗涤条件（如含SDS的缓冲液），有助于降低非特异性背景。

（4）适合研究稳态条件下的蛋白质组织和长时间存在的互作。

（5）高灵敏度，能检测到微弱或间接的邻近关系.

• 劣势：

（1）标记时间长，这导致其时间分辨率极低，无法捕捉快速、瞬时的动态蛋白质互作。

（2）BirA*酶及其衍生物BioID2的分子量相对较大，与POI融合后可能影响POI的正确折叠、定位、功能或与其他蛋白的天然互作。

（3）标记效率相对较低，可能需要较高的POI-BirA*表达水平或较多的起始细胞量才能获得足够的标记产物进行质谱分析。

（4）生物素作为小分子，其在细胞内的分布可能不均匀。

（5）标记的是赖氨酸残基，如果POI的邻近蛋白表面缺乏暴露的赖氨酸，则可能被漏检。

2.TurboID及其衍生技术

TurboID是通过对BirA进行多轮随机诱变和筛选获得的工程酶。其核心优势在于催化效率远超BioID中的BirA*。TurboID能够在极短的时间内将生物素转化为活性的生物素酰-5'-AMP，并高效地标记邻近蛋白质的赖氨酸残基，这种标记速度使其能够捕捉到传统BioID难以企及的快速动态过程。

优劣势分析

• 优势：

（1）标记速度极快，通常10分钟即可完成有效标记，时间分辨率远高于BioID，能够捕捉到瞬时或动态的蛋白质互作。

（2）标记效率高，由于酶活性强，通常能在短时间内获得足够的生物素化产物，可能对POI的表达量要求相对较低，或所需细胞量较少。

（3）适用范围广，可用于培养细胞、组织样品以及多种模式生物的活体标记。

（4）操作相对简便，与APEX相比，无需添加H₂O₂。

• 劣势：

（1）潜在背景较高，由于酶活性极高，如果POI-TurboID表达量过高，或标记时间控制不当，可能会导致生物素酰-5'-AMP过度扩散，标记到更多非特异性的“旁观者”蛋白，从而增加背景噪音。

（2）潜在细胞毒性，长时间高水平表达TurboID或长时间进行标记，可能会对细胞产生一定的毒性或生理负担。

（3）需要精确控制，标记时间和淬灭步骤需要精确控制，以确保实验的可重复性和结果的可靠性。

3.APEX及其衍生技术

APEX是一种经过基因工程改造的植物抗坏血酸过氧化物酶。其核心工作机制是：在H₂O₂存在的条件下，APEX能够催化底物生物素-苯酚氧化，产生寿命极短但反应活性极高的生物素-苯氧基自由基。这些自由基一旦产生，会迅速与其产生位点附近蛋白质表面富含电子的氨基酸残基发生共价连接反应，从而实现对邻近蛋白质的生物素化标记，由于自由基寿命极短，其扩散距离非常有限，理论上可将标记范围限制在几纳米内，从而提供极高的空间分辨率。

优劣势分析

• 优势：

（1）极高的时间分辨率，标记时间可短至秒级到1分钟，是目前时间分辨率最高的邻近标记技术之一，非常适合研究快速动态过程。

（2）极高的空间分辨率，由于活性自由基寿命短，扩散距离有限，标记半径非常小，能够实现纳米级别的空间定位。

（3）APEX2酶分子量较小，约27kDa，与POI融合时产生的潜在干扰相对较小。

（4）可用于活细胞和固定细胞， 但活细胞应用需更谨慎控制H₂O₂。

• 劣势：

（1）H₂O₂的细胞毒性，这是APEX/APEX2最主要的局限。即使使用低浓度和短时间的H₂O₂处理，也可能对细胞产生氧化应激，干扰细胞正常的生理状态，甚至导致细胞损伤或死亡。

（2）生物素-苯酚底物的性质，BP底物自身的细胞膜通透性、在不同亚细胞区室的分布以及潜在的非特异性反应或背景信号也需要考虑。

（3）实验条件优化要求高，H₂O₂浓度、标记时间、淬灭条件的优化对于获得可靠和可重复的结果至关重要，操作相对复杂。

三、总结与展望

邻近标记技术无疑为现代生物学研究，特别是蛋白质组学和细胞生物学领域，带来了革命性的突破。它们使得研究者能够在活细胞甚至活体生物的生理条件下，以前所未有的时空分辨率捕捉蛋白质的网络和亚细胞定位，极大地拓展了对复杂生命过程的认知边界。

选择合适的邻近标记技术，核心在于清晰地界定研究目标，充分了解样本特性，并结合实验室的实验条件和可用资源进行综合考量。在许多情况下，结合多种邻近标记技术或与其他互作研究方法（如Co-IP）相互验证，可能会得到更全面和可靠的结论。随着技术的不断创新和完善，邻近标记这把“钥匙”必将为我们打开更多通往生命奥秘的大门，助力科学家们在细胞的微观世界中不断探索，揭示更多未知的生命规律。