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DAP-seq测序（DNA亲和纯化测序）！

news 来源：原创 2025/6/13 11:48:12

原文链接：DAP-seq测序（DNA亲和纯化测序）！

DAP-seq

DAP-seq的全称是DNAaffinity purification purification sequencing，即DNA亲和纯化测序，该技术通过体外表达转录因子鉴定转录因子结合位点（Transcription factor binding site，TFBS），不受抗体和物种限制，且具有高通量的优势，该技术自问世以来，已被广泛应用于转录调控和表观组学的研究。

DAP-seq实验原理

体外表达的蛋白和DNA进行亲和纯化，将与蛋白结合的DNA洗脱后进行高通量测序。其基本过程是将编码转录因子的CDS序列构建到含有亲和标签（Halo-Tag）的载体中，构建蛋白表达载体，进行体外蛋白表达，形成转录因子和亲和标签的融合蛋白；提取样品的基因组DNA，构建DNA文库，然后将体外表达的带有亲和标签的转录因子和DNA文库进行结合，随后把结合的DNA洗脱后上机测序。

DAP-seq优点

DAP-seq成功将体内结合实验转移到体外，解决了ChIP抗体制备的困扰，极大的提高 DNA Binding Site发现的效率。 DAP-seq不仅能够超高通量查找TFBS，还能深入了解众多TF的生物学特性和结合位点结构，在任何有机体的顺反和表观研究中表现出巨大的价值。

具体方法为：通过体外蛋白表达技术，表达出带有标签的转录因子，和基因组 DNA 文库在体外进行结合，然后分离出所有与转录因子结合的 DNA，再使用高通量测序，找到转录因子的结合位点。

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缺点

很多TF在体内起作用必须要有其他配体蛋白的协助，但在体外环境下，缺乏这些条件；体外环境下，蛋白翻译后无法正常折叠或形成多聚物，从而无法行使在体内环境类似的功能。这与TF的类型（即TF家族）高度相关，因此，如果想用DAP-seq研究某个目标TF，则可以先查询在之前的研究中，该TF隶属家族的成功率如何，从而预估目标TF的实验成功率。
DAP-seq无法检测组蛋白修饰、染色体开放程度等因素对TF作用的影响，因此，DAP-seq不适用于研究TF与DNA作用的动态变化，研究静态TFBS时，一个物种只需做一次。

试验流程

分析流程

例子

文章：ZmGI2 regulates flowering time through multiple flower development pathways in maize

作者利用Ac-Ds转座子系统构建zmgi2突变体，发现zmgi2突变体在长日照（LD）条件下比野生型开花更早，而在短日照（SD）条件下开花时间的差异并不明显。

ZmGI2调控玉米开花时间(Li et al., 2023)。（a）zmgi2突变体中Ds转座子插入位置的示意图；（b）在LD和SD条件下zmgi2突变体和WT植株的表型；（c）在LD和SD条件下zmgi2突变体和WT植株开花的天数；（d）ZmGI2在第3至第9片完全展开的叶片和茎尖分生组织（SAM）中的表达模式；（e）ZmGI2在SAM中的表达显示出昼夜节律。

作者利用RNA-seq和DAP-seq技术探究ZmGI2的靶基因，发现ZmGI2可以与AGTTGTAG和GGTAAACAAGGT这两个基序（Motif）特异性结合（图4），进一步利用凝胶迁移实验（EMSA）和双荧光素酶报告基因实验（Dual-LUC）证明ZmGI2通过直接结合ZmVOZs、ZmZCN8和ZmFPF1的上游区域来抑制这些基因的表达，并直接结合ZmARR11、ZmDOF和ZmUBC11的上游区域来促进这些基因的表达，从而延缓开花。

DAP-seq技术分析ZmGI2的结合位点(Li et al., 2023)。（a）ZmGl2在酵母中的转录活性分析；（b）使用Gal4/UAS系统对ZmGI2的转录活性进行瞬时测定；（c）在玉米原生质体中瞬时表达ZmGI2-GFP融合蛋白的核定位；（d）ZmGI2的两个结合基序；（e）两个生物学重复的结合峰数量；（f）ZmGI2结合位点在玉米基因组中的分布；（g）DAP-seq和RNA-seq结果之间的重叠基因；（h）EMSA结果证实ZmGI2与GGTAAACAAGGTA和AGTTGTAG体外结合。

参考：

Bartlett A, O’Malley R C, Huang S C, et al. Mapping genome-wide transcription-factor binding sites using DAP-seq[J]. Nature Protocols, 2017, 12(8): 1659-1672.
Li Z, Gao F, Liu Y, et al. ZmGI2 regulates flowering time through multiple flower development pathways in maize. Plant Science. 2023, 332: 111701.
https://m.baidu.com/bh/m/detail/ar_10318223045417311191
https://www.seqhealth.cn/productinfo/2208683.html
http://www.igenebook.com/pro_43862233.html
https://www.zoonbio.com/antibody/dap-seq-service.html
https://www.biomart.cn/infosupply/113316386.htm