HepG2细胞复苏实验以及六孔板种植细胞实验

一、细胞复苏实验：

        首先先用紫外照射复苏细胞的新培养皿，然后预热要用到的1640培养基（控制在30mins以内，否则会发生蛋白质结构转变等），等待培养基预热完毕后。取出冻存的HepG2细胞，手拿头部在水浴锅中摇晃解冻。

        随后，取用10ml的离心管，用1ml枪将冻存的细胞液取出，加入10ml离心管中，然后再加入4ml培养基，在5min 600rpm的转速下离心，倒出培养基和冻存液的混合溶液，并用干的棉花擦去离心管口的培养基，随后，再向离心管中加入5ml的培养基，以及培养皿中加入5ml的培养基。将离心管中的培养基混匀三次后加入培养皿中，于显微镜下观察其细胞状态。（新复苏的细胞需要在8个小时以后观察状态，决定换液、传代）。

        8个小时以后，观察酚红变黄，数量过密。故倒去上层培养基，使用PBS清洗两次，吸取剩余的PBS。然后采用胰蛋白酶吹打其表面，观察消化情况，用1ml的枪吸取胰蛋白酶液，再加入5ml的培养基，沿着三个120°吹打三次，放置于10ml的离心管中在5min 600rpm的速度下离心。同样倒掉培养基，加入5ml培养基，并取三个培养皿，在每个培养皿中加入7.5ml培养基，然后再向每个培养基中加入1.5ml混匀的细胞培养基，于显微镜下观察其生长状态。

二、六孔板种植实验：

        和上述细胞传代实验一致，直至离心后加入5ml培养基。然后，使用10ul的枪各取10ul放在白细胞计数板上，通过观察四个象限的细胞数，求出混匀后细胞培养基中的细胞数量（为平均数（控制在30~50最佳）*10^4），种植两个六孔板至少需要一个培养皿。然后通过CV=CV公式求出需要加入的培养基体积（每个六孔板中每个空需要2ml，是所以每个六孔板需要15ml），记住，六孔板的单位是10^5。

        然后，在六孔板中加入载玻片用于正置细胞成像（摔一下看是不是一片），加入补偿的培养基后，在槽子中混匀20次，每加入两个孔，混匀十次，混匀后，观察每个孔的疏密程度，随后放入培养箱中。