测序的原理

Sanger
测序原理 https://v.qq.com/x/page/d0124c0k44t.html
illumina
测序原理： https://v.qq.com/x/page/i0770fd7r9i.html
PacBio
第三代 SMRT 单分子测序 https://v.qq.com/x/page/r03534cry7u.html
Ion torrent
测序原理 https://v.qq.com/x/page/v01754s6r82.html
Oxford Nanopore
https://v.qq.com/x/page/v0746ixokzz.html

好的，以下是根据这份讲义内容，对第一、二、三代测序技术相关知识的详细讲解：

一、第一代测序技术（Sanger 测序）

（一）背景与历史

• 时间：1977 年，Frederick Sanger 和 Coulson 开创了双脱氧链终止法（Sanger 测序法），并完成了第一个噬菌体全基因组的测序。
• 意义：开启了现代基因测序的时代，为后续的基因组学研究奠定了基础。

（二）测序原理

• 核心方法：基于 DNA 聚合酶的链终止反应。通过在 DNA 合成过程中随机引入标记了不同荧光染料的双脱氧核苷酸（ddNTP），使 DNA 链在不同位置终止。
• 具体步骤：
  1. 模板制备：将待测 DNA 片段克隆到合适的载体中，获得单链 DNA 模板。
  2. 引物退火：加入短的引物，使其与模板 DNA 的互补序列结合。
  3. 链合成与终止：在反应体系中加入 DNA 聚合酶、dNTP（正常脱氧核苷酸）和少量标记了荧光的 ddNTP。DNA 聚合酶从引物开始延伸 DNA 链，当随机遇到一个 ddNTP 时，链合成终止。
  4. 电泳分离与检测：将反应产物在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，根据荧光标记的 ddNTP 不同，产生不同颜色的荧光信号，通过检测荧光信号的位置和颜色，确定 DNA 序列。

（三）特点

• 优点：
  • 准确性高：单次测序的准确性可达 99.9% 以上，适合对准确性要求极高的应用，如基因组参考序列的构建。
  • 读长较长：单次测序读长可达 500-1000 个碱基，能够覆盖较长的 DNA 片段，减少拼接错误。
• 缺点：
  • 速度慢：每次测序只能处理一个 DNA 片段，通量低，难以满足大规模基因组测序的需求。
  • 成本高：设备和试剂成本较高，不适合大规模应用。

二、第二代测序技术（Next-Generation Sequencing, NGS）

（一）背景与历史

• 时间：2005 年左右，随着 Roche 454 测序仪和 Illumina Solexa 测序仪的推出，第二代测序技术逐渐成熟并广泛应用。
• 意义：极大地提高了测序通量，降低了测序成本，推动了基因组学研究的快速发展，使大规模基因组测序成为可能。

（二）测序原理（以 Illumina 测序为例）

• 核心方法：基于可逆终止化学和边合成边测序（Sequencing by Synthesis, SBS）技术。

• 具体步骤：

• 

  1. 建库：
     • DNA 片段化：将待测 DNA 随机打断成一定长度的小片段（如 300bp-800bp）。
     • 末端修复与接头连接：对 DNA 片段的末端进行修复，并连接上特定的接头序列，使片段能够固定在测序芯片上。
     • 加 index 标签：为不同样本的 DNA 添加独特的 index 标签，便于后续数据拆分。
  2. Flowcell 芯片准备：
     

Flowcell 的结构

• 通道（Lanes）：Flowcell 包含多个通道，每个通道称为一个 lane。图中显示的 flowcell 有八条 lane，意味着可以同时进行八个独立的测序运行。
• 表面修饰：每个 lane 的表面都经过化学修饰，以便能够固定 DNA 片段。这些修饰包括大量的引物，如 P7 和 P5 引物，它们与 DNA 文库上的接头序列互补，从而能够固定 DNA 片段。
• Swath 和 Tile：每个 lane 有两个面，每个面上有三个 swath（区域），每个 swath 包含 16 个 tile（小方格）。因此，每个 lane 总共有 98 个 tile（两面各 48 个）。整个 flowcell 有 768 个 tile（96 lanes × 8 tiles/lane）。

Flowcell 的功能

• DNA 固定：在测序过程中，DNA 片段需要固定在 flowcell 上，以防止在液体流动时被冲走。这是通过 DNA 片段上的接头与 flowcell 表面的引物结合来实现的。

• 大规模并行测序：由于 flowcell 上有大量的 tile，每个 tile 可以独立进行测序反应，因此可以实现大规模并行测序，大大提高测序效率和通量。

• 测序反应容器：所有的测序反应都在 flowcell 上进行，包括 DNA 的固定、扩增和测序。

  • 芯片表面修饰：Flowcell 芯片表面含有大量固定化的引物，与 DNA 片段上的接头序列互补。
  • DNA 固定：将建库后的 DNA 片段加入 Flowcell，使其与芯片上的引物结合。
  4. Cluster 扩增：
     • 桥式 PCR：通过桥式 PCR 扩增，使每个 DNA 片段在芯片上形成一个簇（Cluster），每个簇包含多个相同的 DNA 拷贝，放大信号。
  5. 测序：
     • 边合成边测序：在反应体系中加入带有荧光标记的 dNTP 和 DNA 聚合酶。每次只添加一个 dNTP 到 DNA 链上，通过激发荧光信号并记录，确定碱基类型。
     • 信号处理与碱基识别：将荧光信号转换为碱基序列，生成 fastq 格式的测序数据。

（三）特点

• 优点：
  • 高通量：一次运行可以产生大量的测序数据，适合大规模基因组测序。
  • 成本低：单位碱基的测序成本大幅降低，使基因组学研究更加普及。
  • 应用广泛：可用于基因组组装、变异检测、RNA 测序、单细胞测序等多种应用。
• 缺点：
  • 读长短：单次测序读长较短（通常在 50-300bp），难以处理重复序列和复杂基因组区域。
  • 测序时间长：从建库到测序完成通常需要数天时间。
  • 偏向性：由于 PCR 扩增等步骤，可能导致某些区域的测序偏向性。

三、第三代测序技术

（一）PacBio 测序

1. 背景与历史

• 时间：2010 年左右，PacBio 公司推出了基于单分子实时测序（SMRT）技术的测序仪。
• 意义：提供了超长读长的测序能力，解决了第二代测序技术在处理复杂基因组区域时的局限性。

2. 测序原理

• 核心方法：单分子实时测序（SMRT）。
• 具体步骤：
  1. SMRT Cell 准备：将待测 DNA 样本转移到 SMRT Cell 中，该芯片含有大量零模波导孔（ZMW）。
  2. 文库构建：构建 SMRTbell 文库，将 DNA 片段连接成环状结构，便于多次测序。
  3. 测序过程：
     • DNA 聚合酶固定：在 ZMW 孔底部固定 DNA 聚合酶。
     • 单分子测序：DNA 模板与聚合酶结合，四种不同荧光标记的 dNTP 被逐个添加到 DNA 链上。每次添加一个 dNTP 时，荧光信号被激发并记录，通过信号分析确定碱基类型。
     • 滚环测序：对于环状 DNA 模板，聚合酶可以多次绕环测序，提高测序准确性。
  4. 数据生成：生成长读长的测序数据，如 Polymerase Read、Subreads、CLR 和 CCS 等。

3. 特点

• 优点：
  • 超长读长：平均读长可达 10-70kb，甚至更长，适合复杂基因组的组装和结构变异检测。
  • 高准确性：通过多次测序和算法校正，可以获得高准确性的 HiFi Reads（>99.9%）。
  • 无需 PCR 扩增：避免了 PCR 扩增带来的偏向性，适合低丰度基因的检测。
• 缺点：
  • 数据量小：单次测序产生的数据量相对较小，适合小规模基因组测序。
  • 成本高：测序成本较高，不适合大规模应用。
  • 设备昂贵：测序仪价格较高，不适合小规模实验室购买。

（二）纳米孔测序

1. 背景与历史

• 时间：2014 年左右，Oxford Nanopore 公司推出了基于纳米孔技术的测序仪，如 MinION。
• 意义：提供了实时、长读长的测序能力，适合现场快速测序和长片段基因组分析。

2. 测序原理

• 核心方法：基于纳米孔的电信号检测。
• 具体步骤：
  1. 纳米孔准备：选择合适的生物纳米孔或固态纳米孔，将其嵌入到合成膜中。
  2. DNA 样本处理：将待测 DNA 样本连接上测序接头和马达蛋白，使其能够通过纳米孔。
  3. 测序过程：
     • DNA 通过纳米孔：在电场作用下，DNA 链在马达蛋白的牵引下逐个碱基通过纳米孔。
     • 电流变化检测：每个碱基通过纳米孔时会引起特定的电流变化，通过检测电流变化信号，识别碱基序列。
     • 碱基识别：利用机器学习算法将电流信号（Squiggle）转换为碱基序列。
  4. 数据生成：生成长读长的测序数据，通常以 fastq 格式输出。

3. 特点

• 优点：
  • 长读长：可以生成长达数十万个碱基的测序数据，适合复杂基因组的组装和结构变异检测。
  • 实时测序：数据可以实时生成和分析，适合快速检测和现场应用。
  • 便携性：测序设备轻便，如 MinION 适合野外和现场使用。
• 缺点：
  • 高错误率：初始测序错误率较高（约 5%-15%），但可以通过算法校正和多次测序提高准确性。
  • 数据处理复杂：需要复杂的碱基识别算法和软件进行数据处理。
  • 成本高：虽然单次运行成本较低，但设备和试剂成本较高。

总结

• 第一代测序技术（Sanger 测序）：准确性高、读长长，但速度慢、成本高，适合小规模、高精度的测序项目。
• 第二代测序技术（NGS）：高通量、成本低、应用广泛，但读长短、有偏向性，适合大规模基因组测序和转录组分析。
• 第三代测序技术（PacBio 和纳米孔测序）：长读长、无需 PCR 扩增、适合复杂基因组分析，但数据量小、成本高、设备昂贵，适合特定应用场景，如基因组组装、结构变异检测和现场快速测序。