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为了从单细胞实验中获得有意义的生物数据，需要对大量单个细胞进行分析。这可以通过使用基于压力驱动流控的液滴微流控技术来实现。 本应用说明中描述的微流体平台用于生成皮升大小的微液滴，以单细胞水平封装 HeLa 细胞以供进一步分析。此过程称为单细胞封装（single cell encapsulation）。 所使用的细胞悬液浓度需遵循泊松分布（Poisson law），以确保实验过程中稳定的细胞封装。本方案可适用于封装不同类型的细胞，并能够生成不同尺寸的液滴。
应用
- 肿瘤学（解析由少量细胞亚群携带的突变）
- 免疫学（区分不同类型的免疫细胞或表征稀有免疫细胞群）
- 神经病学（构建详细的单细胞图谱，以识别和理解不同类型的神经元及其在大脑中的连接分子）
- 发育生物学（基于单细胞水平描绘胚胎的整个发育过程）
- 单细胞组学（揭示组织样本的细胞异质性）
- 以及更多可能的应用
单细胞封装设置
流量控制器 OB1 Mk3+
流量传感器
管道、配件和储液器
microfluidic ChipShop Gmbh 生产的 Fluidic 947 或 Fluidic 440 芯片
管道、配件和储液器
硬件
- OB1 流量控制器，至少带有两个 0–2000 mbar通道
- 1 x 流量传感器 MFS 2D 0.4–7 µL/min，用于油溶液
- 1 x 流量传感器 MFS 3D 4,2–80 µL/min，用于细胞悬浮液
- 1 套鲁尔锁入门包
- 2 x 15 mL falcon储液器
- 带疏水通道的微流控芯片
- 用于观察的显微镜
- 用于成像的高速摄像机（可选）
化学品
- HF5-7500 + 1 % FluoSurf 表面活性剂（法国 Emulseo）
- Aquapel（德国 Autoserv）用于疏水处理（可选）
芯片设计
所使用的微流控芯片采用流体聚焦结构，其材质为聚二甲基硅氧烷（PDMS）。微流控通道经过 Aquapel 处理，使通道表面呈疏水性。
根据所需液滴尺寸，可选用不同的商用芯片，以实现相同的实验目标：
- 液滴尺寸在 [10~30] µm 之间：Microfluidic ChipShop（Fluidic 947–液滴发生器芯片）
- 液滴尺寸在 [50~80] µm 之间：Microfluidic ChipShop（Fluidic 440–液滴发生器芯片）
- 液滴尺寸在 [20~50] µm 之间：液滴基因组学
单细胞封装快速入门指南
仪器连接
- 使用气动管路将 OB1 压力控制器连接至外部气源，并使用 USB 数据线连接至计算机。有关 OB1 压力控制器的详细设置说明，请参考 《OB1 用户指南》。
- 将流量传感器连接到 OB1。
- 按下电源开关，启动OB1。
- 启动 Elveflow 软件。Elveflow Smart Interface（ESI）的主要功能和选项详见 《ESI 用户指南》，请参考该指南获取详细说明。
- 在软件中点击 “添加仪器” \ 选择 OB1\ 设置为 MK3+，如有需要，可设置压力通道，给仪器命名后点击 “OK” 以保存更改。此时，OB1 应已列入识别设备列表。
- 首次使用 OB1 需进行校准，请参考 《OB1 用户指南》 进行操作。
- 添加 流量传感器：点击 “添加传感器” \ 选择 流量传感器\ 选择 模拟或数字（若选择模拟传感器，请设置流量工作范围），为传感器命名，选择连接的设备及通道，并点击 “OK” 保存更改。此时，流量传感器应已列入识别设备列表。详细操作请参考 《MFS 用户指南》。
- 打开 OB1 控制窗口。
溶液制备
- 准备油相溶液储液瓶：向储液瓶中加入 HFE-7500 + 1% FluoSurf 表面活性剂，并连接随附的 1/16英寸外径（OD）管路 和 4mm 外径（OD）螺旋管。更多细节请参考视频 《OB1 连接器使用指南》。
- 重复步骤 1，用于本实验所需的 HeLa 细胞悬液水相溶液。
提示：根据泊松分布，并结合特定的液滴体积，精确计算并制备 HeLa 细胞悬液的浓 度[1]。建议使用较低的细胞浓度，以减少包含两个或以上细胞的液滴数量。推荐的λ 值范围为 0.05 至 0.1（当λ= 0.05 时，尽管仅有 5% 的液滴会包含细胞，但其中 98% 仅封装单个细胞）。
- 可选项：如需收集并重新注入液滴乳液，可准备一个收集瓶，其中预先加入 HFE-7500 + 1% FluoSurf 表面活性剂，以确保液滴在收集后仍处于稳定环境中。
- 如有需要，可对微流控芯片进行疏水处理，例如使用 Aquapel（Autoserv，德国）进行表面改性。
提示：Aquapel 遇空气后会发生结晶，最佳的芯片处理方法如下：
(i) 用氩气冲洗芯片；
(ii) 注入Aquapel进行表面处理；
(iii) 再次用氩气冲洗芯片；
(iv) 最后用HFE-7500油相进行润洗。
单细胞封装
- 流量测量：在微流控储液瓶与芯片之间连接流量传感器。详细操作请参考 《MFS 用户指南》
- 油相预充填：将油相溶液的压力设置为低压（例如 50 mbar），直至溶液从管路末端滴出，然后将管路连接至对应的入口，确保微流控芯片充满油相。
- 对细胞悬浮液重复步骤2。
提示：为防止实验过程中细胞沉降，可对 Falcon 管 施加 轻微搅拌 或 涡旋振荡。 具体方式可根据细胞类型和实验时长选择合适的选项。
- 施加压力与流速：
- 油相溶液：施加 300 mbar压力或设定 45 µL/min 流速。
- 细胞悬液：施加 220 mbar压力或设定 10 µL/min 流速。
- 以上参数可用于制备约 50 µm 直径的液滴。
提示：步骤 4 中提供的参数可适当提高，以增加液滴的生成频率，但需保持流速比恒 定。
- 收集乳液：在出口处使用收集瓶采集乳液，以便进行后续实验。
提示：确保出口端浸没在含有油相和表面活性剂的溶液中，以维持液滴存储的稳定环境。
单细胞分析
在本应用说明中，细胞溶液（1.375 × 10⁶ cells/mL）按照泊松分布（λ= 0.096） 进行封装，所生成的液滴平均直径为 51.2±1.2 µm，变异系数（CV）为 2.4%。
生成的液滴，平均直径为 51.2 ± 1.2 µm。其中可见 四个分别封装单个细胞的液滴。
| Droplet diameter | 0 cell per droplet | 1 cell per droplet | ≥2 cells per droplet | |
| Theory | 50 µm | 91.4 % | 8.2 % | 0.4 % |
| Experimentally | 51.2±1.2 µm | 90.9 % | 8.7 % | 0.4 % |