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AAT Bioquest新型钙离子荧光探针Calbryte 520, AM是一种高性能的荧光染料，广泛应用于活细胞钙离子（Ca²⁺）动态变化的实时监测。以下是其应用领域及核心优势的详细分析：

一、主要应用领域

活细胞钙成像

神经元活动研究：监测动作电位或神经递质释放触发的钙瞬变，适用于脑片或原代神经元。

心肌细胞研究：分析心肌收缩过程中的钙振荡及信号传导。

免疫细胞激活：检测T细胞、巨噬细胞等免疫应答时的钙信号。

高通量筛选

用于药物开发中靶向钙通道或GPCR受体的化合物筛选（如拮抗剂/激动剂效应评估）。

多参数荧光联用

兼容GFP/RFP等荧光蛋白或其他探针（如线粒体染料），支持多色成像。

长期动态追踪

适用于数小时的长时间钙信号记录（如昼夜节律相关研究）。

二、核心优势

卓越的光稳定性与信噪比

相比传统探针（如Fluo-4），Calbryte 520的荧光强度更高，光漂白速率更低，适合长时间或高分辨率成像（如共聚焦、双光子显微镜）。

更高的钙亲和力与灵敏度

Kd ~320 nM，在低钙浓度下仍能清晰响应，可检测微小的钙波动（如亚细胞器钙释放）。

优异的细胞渗透性与负载效率

乙酰氧甲酯（AM）形式：无需显微注射，温和穿透细胞膜，且胞内酯酶水解效率高，适合难转染细胞（如原代细胞、干细胞）。

低细胞毒性

长时间孵育（如>2小时）对细胞活性影响较小，减少实验干扰。

兼容性广泛

激发/发射波长（Ex/Em: 490/520 nm）适配常规FITC滤光片系统，与流式细胞仪、微孔板读数仪等设备匹配。

pH不敏感性

在生理pH范围内（6.5-8.0）荧光信号稳定，避免因代谢酸化导致的假阳性。

三、使用注意事项

负载条件优化：建议使用含Pluronic F-127的缓冲液（如HBSS）增强疏水性AM酯的溶解性。

校准建议：需结合钙离子载体（如ionomycin）和EGTA进行原位校准，以定量绝对钙浓度。

多色实验设计：需注意与其他探针的光谱重叠（如绿色通道），建议通过线性 unmixing 校正。

四、对比传统探针(如Fluo-4, Rhod-2)

特性	Calbryte520, AM	Fluo-4, AM	Rhod-2, AM
Kd (nM)	~320	~345	~570
信噪比	高	中等	较低(红色通道)
光稳定性	★★★★★	★★★☆☆	★★★★☆
胞内滞留性	优（低泄漏）	中等	易泄漏

Calbryte 520, AM凭借其高灵敏度、低毒性及广泛的兼容性，成为复杂钙信号研究（如神经科学、药理学）的理想工具，尤其在需要长时间或高时空分辨率成像的实验设计中优势显著。

图示：

图1.Calbryte 520 AM（# 20653）和 Fluo-4, AM（# 20550）在 CHO-K1 细胞中测量了 ATP 反应。CHO-K1 细胞以每孔 50,000 个细胞/100 µl的密度在 96 孔黑色壁/透明底 Costar 板中过夜培养。向孔中加入 100 µl 10 µg/ml Calbryte 520 AM 或 10  µg/ml Fluo-4， AM 的 HH 缓冲液，在 37°C 下孵育 45 分钟。移除两种染料加载溶液，每孔加入 200 µl HH 缓冲液。每孔加入 50 µl ATP，以达到最终浓度为 10 µM。在 Keyence 显微镜的 FITC 通道中获取图像。

图2.通过激光扫描共聚焦显微镜分析了细胞内游离钙离子的分布情况。细胞内游离钙离子通过红色荧光探针Rhod-2 AM（#21060）进行检测。细胞核用 DAPI（蓝色）染色。携带 eGFP 报告基因的 pEZ-LV203 载体产生绿色荧光蛋白。