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IF6.7|多组学与网络药理学分析揭示龟龄集治疗少精症的机制

2024年10月28日，海军军医大学张卫东教授团队在Phytomedicine（IF=6.7）上发表了题为“Multi-omics and network pharmacology approaches reveal Gui-Ling-Ji alleviates oligoasthenoteratozoospermia by regulating arachidonic acid pathway”的文章，龟龄集（GLJ）最早记载于宋代，可以缓解疲劳和遗精症状。临床常用于治疗早泄、勃起功能障碍和少精症，有研究表明，GLJ可有效改善大鼠性功能障碍，早期研究中已经对GLJ进行体内外成分鉴定，但是GLJ在少弱畸精子症（OAT）中的作用成分和作用机制尚不清楚。在本研究中，作者通过多组学和网络药理学相结合的综合策略深入研究GLJ治疗OAT的作用机制，首先采用环磷酰胺（CTX）建立了OAT模型，初步评价GLJ的药理作用，随后采用多组学和网络药理学整合分析来阐明潜在的机制。最后进行细胞验证试验，确定GLJ的潜在靶点和有效成分。

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摘要

OAT是男性不育的最重要原因之一，具有三个主要特征：精液样本中精子数量减少，形态异常，精子活力差。吸烟、饮酒和肥胖是OAT的主要因素。它们可导致精子细胞生长受损、精子浓度降低、性腺功能减退、血清睾酮（T）和黄体生成素（LH）水平降低。环磷酰胺（CTX）通常用于构建OAT模型，因为它能够降低生殖器官的重量，降低精子数量和活力。目前，除手术治疗外，他莫昔芬、克罗米芬等抗雌激素药物以及辅酶Q10、维生素E等抗氧化剂被广泛用于治疗特发性男性不育症，但这些药物中的大多数并未在各国获得批准用于治疗OAT。越来越多的人需要发现更安全、更有效的临床用药，而中药是一个有吸引力的选择，因为一些草药配方已被用于治疗男性不育症多年。GLJ可以缓解疲劳和遗精症状。临床常用于治疗早泄、勃起功能障碍和少精症。早期研究中已经对GLJ进行体内外成分鉴定，但是GLJ在OAT中的作用成分和作用机制尚不清楚。在本研究中，通过多组学和网络药理学相结合的综合策略深入研究GLJ治疗OAT的作用机制。

图1 图文摘要

2.主要结果

2.1 GLJ****提高大鼠精子活性，调节血清性激素水平

CTX造模后第15 ~ 17天，OAT大鼠体重明显下降，而GLJ- L和GLJ- H组大鼠体重减轻明显慢于OAT模型组，GLJ能有效减缓CTX引起的体重下降（图2A）。对附睾精液进行检测和分析，OAT组大鼠精子数量和活力显著降低，GLJ组大鼠精子数量和活力显著增加（图2B- C）。此外，OAT大鼠血清LH、FSH和T水平明显降低，但GLJ治疗后改善（图2D-F）。睾丸H&E染色切片显示， OAT组精子小管组织紊乱，小管形态萎缩，管腔内生精细胞数量明显减少，经GLJ-H处理后，OAT大鼠精小管萎缩和生精细胞数量减少得到缓解（图2G - L）。

图2 GLJ对CTX所致OAT大鼠的影响。

2.2 大鼠血清和尿液的代谢组学和脂质组学分析

通过对OAT和GLJ引起的内源性差异代谢物（DMs）的分析，在尿液和血清样本中分别鉴定出106种和85种内源性差异代谢物（图3A-B）。代谢组学鉴定的88种DMs（尿液中37种，血清中51种）受GLJ调控（图3D-E）。血清中65%的差异代谢物为脂质代谢物。因此，对血清进行脂质组学分析，鉴定出159种脂质DMs（图3C），GLJ调节的54种DMs的包括33%的甘油磷脂，20%的甘油脂，17%的类固醇，6%的鞘脂等（图3F）。在这些DMs中，OAT组花生四烯酸（AA）水平显著高于Sham组，GLJ-L和GLJ- H组的AA水平显著低于OAT组。同时，与AA相关的脂质DMs（PGE2、PGE2a、白三烯E4、12-HETE）在GLJ-L和GLJ-H组显著升高。GLJ可以显著逆转OAT诱导的代谢物，特别是脂质代谢物的破坏。

图3 通过代谢组学和脂质组学实验鉴定了内源差异代谢物

2.3 DMs****的功能分析

将GLJ调节的DMs进行通路分析。3组的鞘脂代谢均被DMs富集，而甘油磷脂代谢和不饱和脂肪酸的生物合成途径则被OAT组与Sham组或GLJ组与OAT组的DMs富集（图4A）。最后确定了鞘脂代谢、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢和醚脂代谢4种途径（图4B）。接下来，构建一个由四个通路和相关的DMs组成的代谢物通路网络（图4C）。该网络中的8种DMs在OAT组和GLJ组中相反表达，其中7种由OAT增加的代谢物在GLJ处理后被下调，尤其是花生四烯酸和鞘氨醇（图4D）。对尿液中的54种DMs进行类似的分析，OAT组与Sham组中有3条通路富集（图4E），其中DMs在11条通路中发挥关键作用（图4F）。然而，在OAT vs Sham组和GLJ vs OAT组中，只有戊糖和葡萄糖醛酸相互转化这一途径富集。接下来，DMs通路网络包括5个相互连接的模块（图4G），该网络中只有一个代谢物在OAT与Sham组和GLJ与OAT组中相反表达。OAT组去甲肾上腺素升高，GLJ-L组降低。GLJ可能通过调节去甲肾上腺素来提高男性生育能力（图4H）。

图4 代谢组学和脂质组学实验鉴定血清中DMs的途径分析

2.4 大鼠睾丸差异表达基因的鉴定与功能分析

对GLJ处理大鼠与未处理大鼠进行差异表达基因（DEGs）分析，最终鉴定出305个DEGs。将OAT vs. Sham组和GLJ vs. OAT组相反表达的23个DEGs（图5A-B）输入STRING进行功能注释，富集出3条途径，包括网格蛋白依赖性内吞作用、淋巴细胞迁移的正向调节和内分泌抵抗。这些途径与免疫和内分泌系统的生物过程有关。然后将GLJ-H和OAT组的DEGs进行功能富集分析，OAT vs Sham组和GLJ-H vs OAT组富集的生物过程（BP）和分子功能（MF），包括生物体发育和免疫过程（图5C）。GLJ-H组与OAT组中富集的生物过程与神经功能和免疫过程有关（图5D）。细胞组分和分子功能的富集表明，GLJ-H处理可以调节免疫系统、生物氧化和脂质代谢过程（图5E）。

图5 差异表达基因（DEGs）的功能分析

2.5 多组学结果与GLJ潜在靶点的集成网络分析

根据代谢组学和脂质组学鉴定的GLJ-H和OAT组的DMs和DEGs构建代谢网络，通过代谢物、DEGs的人类同源物和GLJ靶点构建GLJ基因-代谢物网络（图6A）。利用网络中的基因和代谢物确定了前30条通路，包括内分泌系统、免疫系统和脂质代谢（图6B）。提取各组DMs及相关基因，构建GLJ基因- DMs网络，发现PC （22:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)）、花生四烯酸、硫酸雌酮和鞘氨氨酸OAT中与GLJ的治疗密切相关（图6C、D）。接下来，确定了7个靶点评分大于5的关键靶点（ESR1、AR、ABCB1、ABCC1、ALB、PLA2G1B、NOS2）为OAT中GLJ的关键靶点（图6E）。进一步，将OAT和GLJ组中7个关键靶点和相反表达的23个DEGs输入STRING中寻找功能关联，发现8个DEGs （ABCB11、ALDH18A1、CCL3、CD244、CIITA、CYP2C8、DLL1、ITGA4）与7个关键靶点连锁。通过综合网络分析，确定了OAT中GLJ的关键分子，包括4个关键代谢物、7个关键靶点和8个关键DEGs。最后，构建了9种草药、71种成分、19种关键分子和30种途径之间相互作用的草药-成分-关键分子通路网络，主要可分为5类（氨基酸代谢、脂质代谢、神经系统、免疫系统、内分泌系统），其中类固醇激素的生物合成是最重要的（图6F）。此外，GLJ中作用于类固醇激素生物合成关键靶点的8种成分被预测为GLJ治疗OAT的潜在活性成分。在19个关键靶点中，花生四烯酸是网络中最突出的代谢物节点。因此，预计花生四烯酸代谢在GLJ治疗OAT中具有关键作用。

图6 多组学结果与GLJ潜在靶点的集成网络分析

2.6GLJ及其成分对T****分泌的影响

GLJ(补骨脂素、异补骨脂素、淫羊藿苷、甘草苷、异甘草苷、甘草素、熊果酸和人参皂苷Ro与OAT的治疗密切相关。因此，采用TM3体外实验对8种化合物和GLJ进行评价，结果表明，GLJ以浓度依赖的方式显著提高T分泌水平（图7A-F）。在8种化合物中，补骨脂素对T分泌的影响最大，在5 μM下可显著促进T分泌。

2.7 AA代谢参与T****分泌

为了研究AA代谢在GLJ治疗OAT中的重要性，我们从定量和时间关系的角度研究了AA在T分泌中的作用。10-7 M~10-4 M AA在处理3小时和24小时后显著促进TM3中T的分泌，但处理3小时和24小时后T的分泌无显著差异（图7H - I）。GLJ （80 ng/ml）可促进AA的这种作用， GLJ （80 ng/ml）能显著增加TM3中T的分泌，而阿司匹林（25 μM，环氧化酶抑制剂）能显著降低GLJ的促进作用，抑制率为50%（图7J）。与阿司匹林单独治疗相比，阿司匹林联合Zileuton （25 μM，脂氧合酶抑制剂）对GLJ刺激的抑制作用相似。

图7 TM3中T分泌水平的测定

3. 小结

近年来，OAT已成为一个普遍的男性健康问题，男性的精子数量和生存能力明显下降。GLJ是一种具有百年使用历史的中草药方剂，临床上常用于治疗包括OAT在内的一些男性疾病。本研究首次采用综合网络药理学和多组学方法系统阐明了GLJ的作用机制和化合物。GLJ、补骨脂素、异补骨脂素、异甘草素、甘草素和人参皂苷Ro均能显著提高TM3的T水平。因此，这五种成分可能是GLJ治疗OAT的有效成分。此外，花生四烯酸代谢加环氧酶途径通过促进TM3的T分泌，与GLJ的治疗显著相关。

参考文献

Zhu R, Gao Z, Wu S, Ma S, Zhu Y, Zhang S, Zhang Y, Zeng H, Ma C, Zhao J, Ye J, Zhang W. Multi-omics and network pharmacology approaches reveal Gui-Ling-Ji alleviates oligoasthenoteratozoospermia by regulating arachidonic acid pathway. Phytomedicine. 2024 Oct 28;135:156184. doi: 10.1016/j.phymed.2024.156184. Epub ahead of print. PMID: 39488872.