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一、工具简介

methylKit 是R语言环境下用于高通量亚硫酸盐测序（如RRBS、WGBS）甲基化数据分析的专业包。它支持从原始测序数据到差异甲基化分析、注释和可视化的全流程，适用于CpG、CHG、CHH等多种上下文。

主要功能包括：

• 读取多种格式的甲基化位点文件（如Bismark、BSMAP等）
• 甲基化水平统计与可视化
• 差异甲基化位点/区域检测
• 基因组注释与富集分析
• 支持大数据的磁盘索引（tabix）

二、安装方法

1. Bioconductor推荐安装

在R或RStudio中运行：

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("methylKit")

2. Conda安装（推荐用于依赖复杂的环境）

conda install -c bioconda bioconductor-methylkit

注意：

• 建议R版本≥4.0，Bioconductor版本≥3.12。
• Conda安装会自动解决依赖问题，适合新手和服务器环境。

3. 检查安装

library(methylKit)
packageVersion("methylKit")

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三、输入文件格式

methylKit支持多种输入格式，最常见的是Bismark、BSMAP等软件输出的甲基化位点表。
典型的tab分隔文件格式如下：

chrBase	chr	base	strand	coverage	freqC	freqT
chr21.9764539	chr21	9764539	R	12	25.00	75.00
chr21.9764513	chr21	9764513	R	12	0.00	100.00
chr21.9820622	chr21	9820622	F	13	0.00	100.00

• chrBase: 染色体和碱基位置
• chr: 染色体
• base: 位置
• strand: 链（F: 正链，R: 负链）
• coverage: 覆盖度
• freqC: 该位点C的比例
• freqT: 该位点T的比例

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四、详细使用流程

1. 读取甲基化位点文件

假设有4个样本（2个实验组，2个对照组）：

library(methylKit)file.list <- list("test1.myCpG.txt","test2.myCpG.txt","control1.myCpG.txt","control2.myCpG.txt"
)myobj <- methRead(file.list,sample.id = list("test1", "test2", "ctrl1", "ctrl2"),assembly = "hg18",treatment = c(1, 1, 0, 0), # 1为实验组，0为对照组context = "CpG",mincov = 10 # 最小覆盖度过滤
)

2. 数据质控与过滤

过滤掉覆盖度过高或过低的位点：

filtered.myobj <- filterByCoverage(myobj, lo.count=10, lo.perc=NULL, hi.count=NULL, hi.perc=99.9)

3. 甲基化水平统计与可视化

3.1 样本间相关性

getCorrelation(filtered.myobj, plot=TRUE)

3.2 PCA主成分分析

PCASamples(filtered.myobj)

3.3 聚类分析

clusterSamples(filtered.myobj, dist="correlation", method="ward", plot=TRUE)

4. 合并样本并统一CpG位点

meth <- unite(filtered.myobj, destrand=FALSE)

5. 差异甲基化分析

myDiff <- calculateDiffMeth(meth)
# 查看显著差异位点
diffMethStats(myDiff, plot=TRUE)

筛选FDR<0.01且甲基化差异大于25%的位点：

myDiff25p <- getMethylDiff(myDiff, difference=25, qvalue=0.01)

6. 区域注释与富集分析

可结合 genomation 包进行注释：

library(genomation)
gene.obj <- readTranscriptFeatures("refseq.hg18.bed")
annotated <- annotateWithGeneParts(myDiff25p, gene.obj)
plotTargetAnnotation(annotated, precedence=TRUE, main="差异甲基化位点注释")

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五、进阶功能

• 大数据支持：methylKit支持tabix索引的磁盘数据库对象（methylRawListDB等），适合全基因组大样本分析。
• 多样本分组：支持多组、多条件的差异分析。
• 可视化：内置多种可视化函数，支持相关性、PCA、聚类、注释分布等。

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六、常见问题与解决

• 依赖包安装失败：建议优先用conda安装，或手动降级data.table等依赖。
• 内存不足：可用methylDB对象，数据存磁盘。
• 输入格式不符：可用readr::read_tsv等R包预处理格式。

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七、参考资料

• methylKit官方文档（强烈推荐）
• Bioconductor methylKit主页
• genomation包注释教程

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总结
methylKit是甲基化测序数据分析的强大工具，适合科研人员从原始数据到生物学解读的全流程需求。建议结合官方文档和本教程，灵活应用于自己的项目中。