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H₂DCFDA是一种可渗透细胞，并检测细胞内活性氧 (ROS) 的探针 (Ex/Em=488/525 nm)，可用于细菌活性氧（ROS）产生的测定。
一、化学性质/溶解性/储存
| 分子量 | 487.29 |
| 分子式 | C24H16Cl2O7 |
| CAS号 | 4091-99-0 |
| 中文名称 | 活性氧(ROS)探针 |
| 溶解性 | DMSO: ≥ 90 mg/mL |
| 储存条件 | -20°C, protect from light |
| 运输方式 | 冰袋运输，根据产品的不同，可能会有相应调整。 |
二、 探针结构与工作原理
1.细胞内水解： 探针扩散进入细胞后，细胞质内的酯酶 (esterases) 会将其乙酸酯基团水解去除，生成中间产物 H2DCF (2',7'-二氯二氢荧光素)。此步骤至关重要，因为水解后的 H2DCF 带负电荷，无法自由穿过细胞膜，从而被有效地滞留在细胞质内。然而，此时的 H2DCF 仍然是非荧光或仅有微弱荧光。
2.ROS 依赖性氧化： 当细胞内存在 ROS（如过氧化氢 H₂O₂、羟基自由基 ·OH、过氧亚硝基阴离子 ONOO⁻ 等）时，H2DCF 会被这些氧化剂不可逆地氧化。氧化反应生成最终的荧光产物 DCF (2',7'-二氯荧光素)。DCF 在特定波长光（激发波长约 495 nm）的激发下，会发出强烈的绿色荧光（发射波长约 529 nm）。荧光的强度与细胞内被氧化的 H2DCF 量成正比，进而间接反映了细胞内 ROS 的总体水平或氧化压力。
三、H₂DCFDA（DCFH-DA）的研究应用
H₂DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）作为一种细胞渗透性探针，能够有效检测细胞内的氧化应激和ROS水平。H₂DCFDA可以检测过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子（O2⁻）、羟基自由基（·OH）和过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）等ROS。一般可将细胞与H2DCFDA（多数情况下浓度为10 µM）孵育30分钟，然后用流式细胞术或者荧光显微镜进检测。注意染色过程中要使用无血清的培养基，以免影响检测结果。近年来，铁死亡（Ferroptosis）研究取得了显著进展，H₂DCFDA作为检测工具在其中发挥了重要作用。通过检测细胞内的ROS水平，并结合ABDP 581/591 C11（AbMoel，M29325）进行脂质过氧化检测，以及CCK8-1（AbMole，M4839）等进行细胞活力分析，可以分析细胞死亡的主要原因和类型。
四、 主要优势与应用
1.细胞通透性与滞留性： 初始的乙酯化形式使其易于穿透细胞膜；水解后生成的 H2DCF 被限制在细胞内，防止探针泄漏。
2.高灵敏度： 能够检测到细胞内相对低水平的 ROS 变化。
3.操作便捷： 实验流程相对标准化，易于在实验室实施。
4.多平台兼容性： 产生的绿色荧光信号可通过多种常用仪器检测：
5.流式细胞术： 高效定量分析大量细胞群体的平均 ROS 水平。
6.荧光显微镜： 可视化观察 ROS 在单个细胞或亚细胞结构中的空间分布（需注意光漂白问题）。
7.荧光酶标仪： 适用于基于微孔板的高通量筛选或动力学时间过程监测。
五、范例详解
1. Sci Adv. 2024 Aug 16;10(33):eado7249.
苏州大学第一附属医院的研究人员设计了一种水凝胶（FDA-TA），它可通过重塑铁代谢来修复组织。FDA-TA可以吸附胞外的铁离子，以调节铁代谢并抑制铁死亡，进而促进组织修复。研究者构建了大鼠尾椎穿刺模型，来评估FDA-TA对椎间盘退行性病变（IVDD）的抑制效果。实验人员在探究铁离子（Fe3+）能否引起细胞氧化应激和铁死亡的实验中，使用了AbMole的H₂DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）和JC-1（AbMole，M9724），它们分别被用于检测活性氧（ROS）的生成和线粒体膜电位的变化[1]。
图 2. Fe3+可以诱导细胞氧化应激和线粒体膜电位异常[1]
2. Plant Biotechnol J. 2023 May;21(5):943-960.
兰州大学、宁夏医科大学的研究者们在上述论文中研究了C2H2型锌指转录因子OSIC1在杨树中对渗透胁迫下气孔关闭的正向调控作用。研究发现，OSIC1在盐、干旱、聚乙二醇6000（PEG6000）和脱落酸（M7597，ABA）诱导下表达上调。过表达OSIC1的转基因杨树在上述处理条件下表现出更强的耐受性，这主要是通过减少气孔开度来实现的。而通过CRISPR/Cas9系统产生的OSIC1突变体则表现出相反的表型。此外，OSIC1能够直接上调PalCuAOζ的表达，该基因编码一种含铜多胺氧化酶，可增强保卫细胞（ guard cells，负责储存淀粉调节渗透压的细胞）的过氧化氢积累，从而在环境压力发生时调节气孔关闭。在这项研究中，AbMole的H₂DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）被用来检测杨树保卫细胞在不同处理条件下的H₂O₂积累情况[2]。
图 3. Detection of H2O2 in guard cells under different treatments[2].
3. Mater Today Bio. 2023 Jun 24;21:100711.
苏州大学第一附属医院的研究者们在上述文章中研发了一种以黑色素为原型的微囊（BHB-PDA-MCs），用于肝纤维化（HF）的抑制。BHB-PDA-MCs的核心为水相，外壳由聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和聚多巴胺纳米颗粒（PDANPs）组成。PDANPs是天然黑色素的合成类似物，具有抗氧化特性。而微囊的核心用于封装酮体β-羟基丁酸（BHB），这是一种已知的免疫代谢调节剂，能够抑制NLRP3炎症体的激活。在体外实验中，PDANPs能够减轻H2O2诱导的肝细胞（LO2细胞）和肝星状细胞（HSC-T6细胞）的氧化水平，而BHB能够减少巨噬细胞（Raw264.7细胞）产生的促炎和促纤维化因子；在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中，研究者发现BHB-PDA-MCs能够抑制HSCs的激活，减少ECM蛋白的沉积，减轻肝小叶的损伤，并保护肝功能。在这项研究中，AbMole的H₂DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）被用来检测LO2和HSC-T6细胞在H2O2刺激下的氧化水平和微囊系统的保护作用。
图 4. Fluorescent images showing the ROS levels in LO2 or HSC-T6 cells after co-cultured with blank control, H2O2, or or PDA-MCs[3]
六、参考文献
[1] Karyne Rangel, et al. Microorganisms. Detrimental Effect of Ozone on Pathogenic Bacteria
[2] Shijing Liao, et al. Int J Nanomedicine. Antibacterial activity and mechanism of silver nanoparticles against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa
[3] Lyublinskaya OG, et al. Redox Biol. Redox environment in stem and differentiated cells: A quantitative approach.
[4] Nicky Pirotte, et al. Oxid Med Cell Longev. Reactive Oxygen Species in Planarian Regeneration: An Upstream Necessity for Correct Patterning and Brain Formation
[5] Carole Gauron, et al. Sci Rep. Sustained production of ROS triggers compensatory proliferation and is required for regeneration to proceed.