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在细胞生物学研究中，细胞活性检测是评估药物毒性、细胞增殖能力的核心实验之一。CCK-8（Cell Counting Kit-8）因操作简便、灵敏度高，成为替代传统 MTT 实验的常用方法。本文将从实验原理、操作步骤到数据处理（含 Graphpad 作图要点）进行详细说明，助力研究者获得可靠结果。
一、CCK-8 实验原理
CCK-8 试剂的核心是WST-8 四唑盐，其检测机制依赖活细胞线粒体脱氢酶的活性：
在电子载体 1-Methoxy PMS 的作用下，WST-8 被还原为水溶性黄色甲瓒产物，生成量与活细胞数量呈正相关。通过酶标仪在 450nm 波长下检测 OD 值，即可间接推算活细胞数量及活性。
CCK-8 与 MTT 的核心区别
| 指标 | CCK-8 | MTT |
|---|---|---|
| 产物性质 | 水溶性甲瓒（可直接检测） | 不溶性甲瓒（需溶解后检测） |
| 操作步骤 | 无需溶解步骤，减少误差 | 需加 DMSO / 异丙醇溶解，操作繁琐 |
| 数据稳定性 | 产物稳定，OD 值波动小 | 溶解不彻底易导致 OD 值偏差 |
| 灵敏度 | 更高（线性范围 0.1-2 OD 值） | 较低（易受溶解步骤影响） |
简言之，CCK-8 通过省去溶解步骤，大幅降低了操作误差，更适合高通量实验。
二、CCK-8 实验操作步骤
（1）细胞铺板：避免边缘效应是关键
- 细胞密度：96 孔板推荐每孔铺 3×10⁴个细胞（具体密度需根据细胞生长速率调整，确保实验终点时细胞不过密）。
- 孔板使用技巧：仅用 96 孔板内圈 60 孔（避开外圈 36 孔），外圈孔加 200μL PBS 或无血清培养基。
原因：外圈孔因环境温湿度波动，液体蒸发速率更快，易导致细胞生长不均或试剂浓度变化，即 “边缘效应”，直接影响数据可靠性。 - 铺板后处理：铺板后轻轻晃动孔板使细胞分布均匀，置于培养箱中静置 24h，待细胞贴壁稳定后再进行后续操作。
（2）给药方式：根据细胞状态选择
- 复孔设置：每组至少 3 个复孔，减少个体差异对结果的影响。
- 药物浓度配制：推荐将药物配制成 2× 终浓度，吸除旧培养基后直接加入等体积含药培养基（如每孔原培养基 100μL，加入 100μL 2× 药物，终体积 200μL）；也可直接向原培养基中加入 1× 药物（需确保体积变化对细胞环境影响可忽略）。
- 操作方式选择：
- 换液法：吸除旧培养基后加含药培养基，适用于细胞贴壁不牢（避免细胞随旧培养基流失）。
- 直接加入法：向旧培养基中直接加药物，适用于细胞状态脆弱（减少换液对细胞的刺激）。
（3）CCK-8 试剂添加与检测
- 添加时机：给药处理后（如孵育 24h/48h/72h），根据实验设计时间点检测。
- 添加比例：按培养基体积的 10% 加入 CCK-8 试剂（如 100μL 培养基中加 10μL CCK-8）。
- 贴壁细胞：可先换新鲜培养基，再加入 CCK-8（减少旧培养基中代谢物对反应的干扰）。
- 悬浮细胞：直接加入 CCK-8 即可（避免离心换液导致细胞损失）。
- 孵育时间：37℃培养箱中孵育 0.5-3h，每 30min 测一次 OD 值，控制 OD 值在 1-2 时终止反应。
关键原理：甲瓒生成量与时间的关系呈 “线性期→平台期”：- 线性期（OD=0.1-2）：生成量与活细胞数严格正相关，数据可靠。
- 平台期（OD>2）：脱氢酶活性饱和，生成速率下降，数据失真。
（4）细胞存活率计算公式
细胞存活率是反映药物毒性或细胞活性的核心指标，计算公式为：
细胞存活率 = [(As - Ab)/(Ac - Ab)] × 100%
- As：实验孔 OD 值（含细胞 + 药物 + CCK-8）
- Ac：对照孔 OD 值（含细胞 + 不含药物 + CCK-8）
- Ab：空白孔 OD 值（含培养基 + CCK-8，无细胞）
特殊情况处理：若检测含氧化还原性药物（如维生素 C），需增设 “药物本底孔（Ad）”（含药物 + 培养基 + CCK-8，无细胞），修正公式为：
细胞存活率 = [(As - Ab - Ad)/(Ac - Ab)] × 100%
（避免药物自身还原 WST-8 导致的 As 值虚高）
三、数据处理与 Graphpad 作图要点
CCK-8 实验的核心数据是不同处理组的细胞存活率，需通过 Graphpad Prism 等工具可视化，并进行统计分析。
（1）数据整理
将原始 OD 值按上述公式计算为细胞存活率后，整理成表格（示例如下）：
| 组别 | 药物浓度（μM） | 复孔 1（存活率 %） | 复孔 2（存活率 %） | 复孔 3（存活率 %） | 平均值 | 标准差（SD） |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 0 | 100.2 | 98.5 | 101.3 | 100.0 | 1.4 |
| 药物处理组 | 10 | 85.6 | 83.2 | 86.1 | 85.0 | 1.5 |
| 药物处理组 | 50 | 62.3 | 60.8 | 63.5 | 62.2 | 1.4 |
（2）Graphpad 作图类型及参数设置
① 柱状图（最常用，展示不同浓度 / 组别的存活率差异）
- 数据输入：X 轴为组别 / 药物浓度，Y 轴为细胞存活率（%）。
- 图表选择：“Column”→“Mean with SD”（显示平均值 ± 标准差）。
- 统计分析：添加显著性标记（如 * p<0.05, *p<0.01），通过 “Analyze”→“One-way ANOVA” 进行组间比较。
- 优化细节：误差线选择 “SD”，坐标轴范围设为 0-120（确保数据分布清晰），添加网格线提升可读性。
② 线性图（展示时间 / 浓度梯度与存活率的动态关系）
- 数据输入：X 轴为孵育时间（h）或药物浓度（对数轴），Y 轴为细胞存活率（%）。
- 图表选择：“XY”→“Line with error bars”。
- 适用场景：评估药物时效关系（如不同时间点的存活率变化），或绘制量效曲线（计算 IC50）。
（3）作图注意事项
- 误差线：必须包含（反映实验重复性），优先用标准差（SD）而非标准误（SEM）。
- 组别标注：清晰区分对照组、不同浓度处理组，避免混淆。
- 统计显著性：仅在有统计学差异时添加标记，避免过度标注。
四、实验关键注意事项
- 试剂选择：推荐使用日本同仁化学的 CCK-8 试剂，批次间稳定性更佳。
- 孵育时间：根据细胞类型调整（如肿瘤细胞代谢旺盛，孵育 1-2h 即可；干细胞代谢较慢，可延长至 3h）。
- 药物干扰：含酚红的培养基不影响检测，但还原性物质（如谷胱甘肽）可能干扰反应，需提前做药物本底对照。
- 复孔数量：每组至少 3 个复孔，若数据波动大，可增加至 5 个。
通过规范操作和合理的数据可视化，CCK-8 实验能高效、准确地反映细胞活性变化。Graphpad 的作图重点在于清晰展示数据趋势和统计差异，为实验结论提供直观支持。希望本文能为研究者提供实用参考，减少实验误差，提升数据可靠性。