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一、实验流程总览
该技术用于检测组织中 miRNA 的空间表达，采用荧光原位杂交（FISH）方法。流程主要包括以下几个阶段：
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组织解剖与预处理
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预杂交处理
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探针杂交
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洗涤去杂
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制片观察
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关键试剂配制与注意事项
二、详细步骤整理
1. 组织解剖与预处理
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麻醉消毒：将动物放在冰上麻醉，75%酒精消毒 3 分钟后用 PBS 清洗。
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组织解剖：在 PBS 或 Grace’s Insect Medium 中解剖所需组织。
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组织固定：4% 多聚甲醛 (PFA) 室温固定 1 小时。
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通透化处理：用 800 µL PBTT 处理 15 分钟，再用 PBTT 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
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PBS 洗涤：PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。
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转入杂交液：用 1:1 的 PBT:RNA 杂交液洗涤，储存在 RNA 杂交液中。
2. 预杂交
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RNA 杂交液煮沸 5 分钟，冰上骤冷 5 分钟。
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将样品加入杂交液中，在 56℃ 下孵育 2 小时。
3. 探针杂交
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探针以 1:50 至 1:2000 的比例稀释于 RNA 杂交液中。
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探针加热至 80℃ 5 分钟后冰浴骤冷 5 分钟（若探针短于 50nt 且无复杂结构可省略）。
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样品加入含探针的杂交液中，在 56℃ 杂交 12 小时（30-80nt 短探针孵育 30 分钟至 2 小时）。
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杂交结束后，转入 DAPI 染色液中染色 30 分钟。
4. 洗涤
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杂交液预热至 56℃，洗涤样品 3 次，每次 15 分钟。
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使用 PBT 洗涤 5 分钟。
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转入 PBS 中再洗涤 5 分钟。
5. 制片
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在体式荧光显微镜下操作：
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滴加抗淬灭剂于载玻片中央，放置样品，解剖脂肪体碎块分散。
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缓慢下压盖玻片，避免左右移动。
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吸除多余抗淬灭剂，用指甲油封闭四周，避光晾干保存。
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三、关键试剂组成（RNA 杂交液）
| 中文名 | 英文名 | 体积 (ml) |
|---|---|---|
| 甲酰胺 | Formamide | 25 |
| 20× SSC 缓冲液 | 20× SSC | 12.5 |
| 肝素（5mg/ml） | Heparin | 0.5 |
| 酵母 tRNA | Yeast tRNA (50mg/ml) | 0.5 |
| 柠檬酸 | Citric acid (0.5M, pH=6.0) | 0.92 |
| DEPC 水 | DEPC-treated H2O | 10.33 |
| 吐温 20 | 20% Tween 20 | 0.25 |
注：酵母 tRNA 需临用前添加。
四、说明与注意事项
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固定液说明：
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4% PFA 是常用固定液，能较好地保持 RNA 和形态结构。
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固定时间过长会导致交联增强，降低探针通透性和杂交效率。
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建议：组织块固定 4-12 小时，载玻片样品固定不超过 15 分钟。
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甘氨酸：
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可抑制蛋白酶 K 的作用，避免样品过度消化。
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