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为了准确评估肿瘤微环境中免疫细胞的构成，我们可以通过很多方法从 RNA-seq 数据中量化肿瘤浸润的免疫细胞。免疫浸润分析的方法大体包括两个思想，一个是 marker gene，还有一个是反卷积思想。

1. CIBERSORT

用于芯片表达矩阵和测序表达矩阵，反卷积

★ 该方法基于已知参考数据集，默认提供22种免疫细胞亚型的基因表达特征集：LM22

2015年发布的算法，可以分析22种细胞浸润的情况，计算出的数值为百分比，可以比较同一样本中不同细胞群体的比例，18年更新的abs mode可以比较不同样本中不同细胞群体的比例。

CIBERSORT输入数据的要求：

1.不可以有负值和缺失值

2.不要取log。有的表达矩阵下载下来就已经取过log，需要逆转回去。有的经过了标准化或者有负值，需要处理原始数据

3.如果是RNA-Seq表达量，使用FPKM和TPM都很合适。

CIBERSORT 免疫浸润(2023.1.2更新版) - 简书

2. TIMER

2016年发布的算法，用于计算肿瘤样本中的6种主要免疫细胞类型（CD4 T，CD8 T，B，Netrophil，DC和macrophage）的浸润水平。TIMER结合了肿瘤纯度的估计，并考虑了肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用。更适用于专门针对肿瘤免疫微环境的研究，特别是当肿瘤样本中的肿瘤纯度可能影响分析结果时。

3. ImmuCellAI

2020年发布算法，针对T细胞亚群做了更多的分类，适用于需要详细T细胞亚群分析的情况。

ImmuCellAI 是一个免疫细胞丰度综合分析网络平台，基于ssGSEA算法估算了包括RNA-Seq和微阵列数据在内的基因表达数据集中 24 个免疫细胞浸润丰度，同时可以预测患者对免疫检查点抑制剂治疗的反应。其中 24 个免疫细胞由 18 个 T 细胞亚型和 6 个其他免疫细胞组成：B细胞，NK细胞，单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和DC细胞。

TIMER和ImmuCellAI计算出的数值均为相对丰度，可比较同一细胞类型在不同样本中的丰度，但不能用于同一样本里不同细胞类型之间的丰度比较。

4. ssGSEA

单样本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA），是针对单个样本无法做 GSEA 而设计的，它可以使用 GSVA R 包来实现。

xcell - Default 是基于 ssGSEA 的方法，可根据 64 种免疫细胞和基质细胞类型的基因表达数据进行细胞类型富集分析。Xcell 的输入文件是来自人类混合样本的基因表达矩阵（基因作为行，样本作为列）。如果基因表达数据来自微阵列，就不需要标准化。如果基因表达数据来自一个测序平台，数值必须被归一化为基因长度(例如，rpkm，tpm，fpkm)。Xcell 使用表达式级别排序，而不使用实际值，因此进一步的规范化不会产生影响。该方法适用于基因表达谱和RNA-seq数据，但不适用于单细胞数据。

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Comprehensive evaluation of transcriptome-based cell-type quantification methods for immuno-oncology | Bioinformatics | Oxford Academic

转录组8种免疫浸润分析方法整理-CSDN博客