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现代细胞计数仪采用自动化方法，在特定浓度范围内进行细胞计数。其上限受限于在高浓度条件下准确区分细胞边界的能力，而相机视野等因素则决定了下限。在图像中仅包含少量可识别细胞或特征的情况下，自动对焦可能会失效，从而影响细胞计数的准确性，并导致变异系数（CV）升高。在常规细胞培养过程中，只要细胞浓度足够，这通常不是主要问题。但当细胞样本浓度极低时，例如在细胞治疗产品制造的初始种子培养阶段，对焦精确度就变得尤为关键。在此类情况下，确保在极低细胞浓度条件下获得清晰的图像是实现精准细胞计数的关键。
为了解决这一问题，我们开发了一种全新的自动对焦算法，采用先进技术准确识别图像中的特征。本技术说明介绍了点成LUNA-FX7™最新软件版本（v1.9.1及以上）的更新内容，该版本针对极低浓度样本优化了自动对焦功能。此外，本文还展示了点成LUNA-FX7™全自动细胞计数仪的卓越性能。
点成LUNA FX7™的自动对焦过程
点成LUNA-FX7™系统采用基于图像对比度的自动对焦算法，以优化聚焦性能。其自动对焦过程由粗略扫描和精细扫描两个阶段组成，确保点成LUNA-FX7™系统具备卓越的对焦能力（图1）。
该过程首先进行粗略扫描，在较宽的Z轴范围内采集图像，以覆盖更大的景深范围，并确定一个大致的焦平面。随后，系统执行精细扫描，在更小范围的Z轴平面上进一步调整焦点，以精准定位最准确的焦平面。该优化过程基于图像特征，确保点成LUNA-FX7™系统实现最佳对焦性能。
图1：图中显示了LUNA-FX7系统自动对焦过程的工作流程，包括粗略扫描和精细扫描
自动对焦的挑战
依赖图像对比度的自动对焦算法在目标物较少或图像特征有限的情况下可能会遇到挑战，从而难以准确确定合适的焦点位置。这一问题通常在粗略扫描阶段较为明显，此时系统难以识别适当的Z轴平面，进而导致后续精细扫描过程中的对焦失败（图2A）。
为解决这一问题，我们开发了一种全新的算法，以增强低细胞浓度或图像特征较少情况下的特征识别能力（图2B）。这种改进算法显著提升了自动对焦过程的准确性和可靠性，在具有挑战性的场景下提供更加精准、稳定的对焦结果。
不同算法在对焦性能上的对比
(A) 算法1未能找到正确的焦点，导致图像模糊，清晰度较差。
(B) 算法2成功识别出合适的焦点位置，呈现出清洗锐利的图像。
自动对焦性能提升
为了验证并展示新开发的自动对焦算法的有效性，我们使用相同的样本对不同版本的点成LUNA-FX7™软件进行了对比实验，结果证实该自动对焦算法的性能得到了显著提升。这一重要改进得益于综合优化策略的实施，有效增强了目标检测的灵敏度，从而在所有视野范围内实现更加精准和稳定的对焦位置（图3）。
升级后的算法即使在图像中目标物数量极少的复杂场景下，依然能够精准定位焦点。在每幅图像目标物少于5个的极低细胞浓度条件下，算法仍能稳定提供准确的对焦结果，充分体现了其卓越的可靠性和适应性。
U937细胞被稀释至2.54 × 10⁴ 个/mL的浓度，使每幅图像中的目标物数量少于5个。完整的12个视野（FOVs）展示如下。算法2能够有效检测并识别目标物（A），而算法1未能实现理想的对焦效果（B）。
结论
点成LUNA-FX7™系统在极低细胞浓度条件下依然能够实现高精度细胞计数。我们优化的自动对焦算法采用综合增强策略，有效提高了目标检测的灵敏度，使对焦性能显著提升。即使在目标物或图像特征有限的情况下，该算法仍能精准识别焦点位置。
这些技术升级使LUNA-FX7™系统成为复杂环境下可靠且高效的细胞计数解决方案。全新自动对焦算法已应用于点成LUNA-FX7™软件版本1.9.1及以上。
