苷类成分通过 PI3K/AKT 信号通路促进内皮祖细胞来源外泌体修复受损血管内皮
血管内皮细胞（VEC）损伤是 CVD 发生发展的起始环节与共同病理基础，无论是动脉粥样硬化、高血压还是经皮冠状动脉介入（PCI）术后再狭窄，均以 VEC 结构破坏与功能异常为核心特征。正常生理状态下，VEC 通过分泌一氧化氮（NO）、前列环素等血管保护分子维持血管舒张功能，同时抑制血小板黏附与平滑肌细胞增殖；而当 VEC 受损时，其屏障功能丧失，促炎因子释放增加，脂质易沉积于血管壁，进而诱发内膜增生与血管狭窄。因此，修复受损 VEC、恢复内皮完整性，成为 CVD 研究领域的关键方向。
干细胞尤其是内皮祖细胞（EPC）相关研究，为血管修复提供了新的思路。EPC 源于骨髓，具有向 VEC 分化的潜能，可响应缺血缺氧信号迁移至损伤部位，通过直接分化或旁分泌效应参与血管新生。然而，EPC 移植面临免疫排斥、染色体异常及血栓形成等问题，严重限制了其应用转化。近年来研究证实，EPC 的修复效应主要依赖其分泌的外泌体（EPC-Exo）—— 这类直径 30-150nm 的脂质双层囊泡可携带蛋白质、脂质及 RNA 等生物活性物质，通过旁分泌方式调控靶细胞功能，兼具抗炎、抗凋亡及促血管生成特性，且无细胞移植的安全风险。但 EPC-Exo 存在产量低、靶细胞摄取效率不稳定等局限，亟需寻找辅助成分提升其生物利用度与修复效能。
补阳还五汤（BYHWD）作为传统中药复方，在缺血性心脑血管病症研究中应用广泛，其核心药理活性依赖于苷类成分，如黄芪甲苷 IV、苦杏仁苷与芍药苷（合称 AAP）。前期研究表明，AAP 可通过调控炎症通路减轻动脉粥样硬化，调节受损血管细胞外基质，还能增强 EPC 向损伤部位的归巢能力。基于此，本研究推测 AAP 与 EPC-Exo 可能存在协同作用，通过激活关键信号通路（如经典的 PI3K/AKT 通路，该通路在细胞增殖、迁移及血管生成中起核心调控作用）增强血管内皮修复效应。本研究通过体内外实验系统验证这一假设，旨在阐明 AAP 与 EPC-Exo 协同修复受损血管内皮的分子机制，为 CVD 相关血管损伤研究提供新策略。
本研究所用PI3K 特异性抑制剂 LY294002（纯度 99.95%，货号 M1925）购自 AbMole bioscience，用于阻断 PI3K/AKT 信号通路以验证通路依赖性。
EPC 的分离与培养参照前期已发表方案（Tan et al., 2024），简要步骤如下：取 SD 大鼠骨髓，通过密度梯度离心分离单个核细胞，接种于铺有明胶的培养皿，使用含 10% 胎牛血清的 EGM-2 培养基，置于 37℃、5% CO₂培养箱培养，每 2 天换液一次，待细胞融合度达 80% 时传代。EPC 鉴定采用免疫荧光染色：细胞爬片后固定，封闭液封闭 1h，加入 CD34（1:200）、CD133（1:200）一抗 4℃孵育过夜，荧光二抗（1:500）室温孵育 1h，DAPI 染核，激光共聚焦显微镜观察；同时检测细胞对 Dil 标记乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）的摄取能力及与 FITC 标记荆豆凝集素 1（FITC-UEA-1）的结合能力，双阳性细胞判定为 EPC。
EPC-Exo 的提取与鉴定：将对数生长期 EPC 换用无外泌体血清培养基培养 24h，收集上清液，依次经 3000×g 离心 10min 去除细胞碎片、12000×g 离心 30min 去除凋亡小体，随后通过 0.22μm 滤膜超滤去除大囊泡，最后使用超速离心机 100000×g 离心 70min（4℃），沉淀用 PBS 重悬即为 EPC-Exo。鉴定方法包括：透射电镜（TEM）观察形态，取 10μL EPC-Exo 悬液滴于铜网，磷钨酸染色，TEM 下观察；粒径分析采用纳米颗粒跟踪分析技术，检测粒径分布范围；Western blot（WB）检测外泌体标志物，提取 EPC-Exo 蛋白，电泳后转印至 PVDF 膜，封闭后加入 CD63（1:1000）、CD81（1:1000）、TSG101（1:1000）一抗 4℃孵育过夜，二抗室温孵育 1h，ECL 显影。
动物实验选用 300-350g 雄性 SD 大鼠，饲养于 22-25℃恒温环境，12h 光暗周期，自由摄食饮水。动物模型构建：大鼠先给予高脂饮食（HFD，含 2% 胆固醇、10% 猪油、88% 基础饲料）14 天，随后腹腔注射 2% 戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉，分离右侧颈动脉，插入 2F 球囊导管，充气后往返牵拉 3 次造成内膜损伤（CABI 模型），假手术组仅分离颈动脉不进行球囊损伤。
大鼠随机分为 5 组（每组 6 只）：假手术组、CABI 组、EPC-Exo 组（术后 12h 及 3 天尾静脉注射 60μg EPC-Exo）、AAP 组（术后次日起灌胃 AAP，剂量按补阳还五汤药材比例计算：黄芪甲苷 IV 20mg/kg/d、苦杏仁苷 280mg/kg/d、芍药苷 108mg/kg/d，连续 14 天）、EPC-Exo+AAP 组（联合上述两种干预）、阿托伐他汀组（阳性对照，灌胃 2.5mg/kg/d，连续 14 天）。术后 14 天，大鼠麻醉后取颈动脉组织与血清，血清置于 - 80℃保存，颈动脉组织部分固定用于病理检测，部分冻存用于 WB 分析。
体内检测方法：颈动脉组织 H&E 染色，固定后脱水、石蜡包埋、切片（4μm），H&E 染色，光学显微镜下观察，ImageJ 软件测量内膜面积（IA）、内膜厚度（IT），计算内膜面积增生率（HRIA = 损伤组 IA / 假手术组 IA×100%）与内膜厚度增生率（HRIT = 损伤组 IT / 假手术组 IT×100%）；血清 ET-1 检测采用 ELISA 试剂盒，酶标仪读取 450nm 吸光度值；颈动脉内膜 CD31 免疫荧光，切片脱蜡至水，抗原修复后封闭，加入 CD31 一抗（1:500）4℃孵育过夜，荧光二抗室温孵育 1h，DAPI 染核，共聚焦显微镜观察并定量荧光强度；WB 检测颈动脉组织 eNOS、Ang1、VEGF 蛋白，提取总蛋白，定量后电泳、转膜，加入一抗（eNOS 1:500、Ang1 1:2000、VEGF 1:2000）4℃孵育过夜，二抗室温孵育 1h，ECL 显影，Image Lab 4.0 软件分析灰度值，以 β-actin 为内参计算相对表达量。
体外实验选用人 VEC，培养于含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基，37℃、5% CO₂培养，取 3-6 代生长良好的细胞用于实验。VEC 损伤模型构建：加入 35μmol/L POVPC 处理 24h（参照前期研究，Ma et al., 2023）；CCK-8 法筛选 AAP 最优浓度：设置黄芪甲苷 IV（5、10、25、50μmol/L）、苦杏仁苷（2.5、5、8.6、10μmol/L）、芍药苷（2.5、5、7.5、10μmol/L）梯度浓度，处理损伤 VEC 24h 后加入 10% CCK-8 溶液，孵育 30-60min，酶标仪检测 450nm 吸光度，结合补阳还五汤中 AAP 比例（黄芪甲苷 IV: 苦杏仁苷：芍药苷 = 69.87:24.1:20.94，Yan et al., 2023a），确定最优组合浓度为黄芪甲苷 IV 25μmol/L、苦杏仁苷 8.6μmol/L、芍药苷 7.5μmol/L。
VEC 分组处理：对照组（正常培养基）、POVPC 组（35μmol/L POVPC）、EPC-Exo 组（50μg/mL EPC-Exo）、AAP 组（最优浓度 AAP）、EPC-Exo+AAP 组（联合干预）、阿托伐他汀组（2.5μmol/L，阳性对照）；另设通路验证组：POVPC 组、LY294002 组（10μmol/L AbMole LY294002）、EPC-Exo+AAP 组、EPC-Exo+AAP+LY294002 组（联合干预 + LY294002），各组处理 24h 后检测相关指标。
VEC 功能检测：增殖能力用 CCK-8 法，细胞接种于 96 孔板，处理后加入 CCK-8 溶液，检测 450nm 吸光度；迁移能力用划痕实验，细胞长满后用 10μL 枪头划痕，PBS 洗去脱落细胞，0h、24h 拍照，ImageJ 计算划痕愈合率（愈合率 =(初始划痕面积 - 24h 划痕面积)/ 初始划痕面积 ×100%）；管形成能力用 Matrigel 实验，96 孔板每孔铺 40μL Matrigel，37℃凝固 30min，接种 1×10⁴个 VEC，培养 8h 后拍照，ImageJ 分析管总长度与管数量；免疫荧光检测 Cleaved-caspase3 与 VEGF，细胞爬片固定后封闭，加入一抗（Cleaved-caspase3 1:200、VEGF 1:200）4℃孵育过夜，荧光二抗室温孵育 1h，DAPI 染核，共聚焦显微镜观察并定量荧光强度；WB 检测 PI3K/AKT 通路蛋白，提取总蛋白，检测 p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、eNOS、Ang1、VEGF 表达，以 β-actin 或总蛋白为内参计算相对表达量；肌动蛋白染色用鬼笔环肽（1:500）室温孵育 1h，DAPI 染核，观察细胞骨架结构。
EPC 与 EPC-Exo 鉴定结果显示，分离培养的细胞经免疫荧光染色呈 CD34、CD133 双阳性，且能有效摄取 Dil-ac-LDL 并结合 FITC-UEA-1，符合 EPC 表型特征；TEM 观察显示 EPC-Exo 呈典型杯状形态，粒径分析表明其直径分布在 30-150nm 范围内，WB 检测到外泌体特异性标志物 CD63、CD81、TSG101 的表达，证实成功分离纯化 EPC-Exo。
体内实验结果显示，H&E 染色表明 CABI 组大鼠颈动脉内膜显著增厚，管腔狭窄明显，IA 与 IT 较假手术组显著升高（p<0.01）；而 EPC-Exo+AAP 组的 HRIA（内膜面积增生率）与 HRIT（内膜厚度增生率）显著低于 CABI 组（p<0.01），且优于单独 EPC-Exo 组或 AAP 组（p<0.05），提示联合干预可显著抑制内膜增生。ELISA 检测显示，CABI 组血清 ET-1 水平较假手术组显著升高（p<0.01），EPC-Exo+AAP 组 ET-1 水平显著降低（p<0.01），表明联合干预可改善血管收缩功能。
免疫荧光结果显示，CABI 组颈动脉内膜 CD31 表达显著减少且不连续，EPC-Exo+AAP 组 CD31 表达显著恢复，呈连续分布（p<0.01），提示内皮修复效果增强。WB 结果显示，CABI 组颈动脉组织 eNOS、Ang1、VEGF 蛋白表达显著低于假手术组（p<0.01），EPC-Exo+AAP 组上述蛋白表达显著上调（p<0.01），且高于单独干预组（p<0.05），证实联合干预可促进血管保护分子表达与血管生成。
网络药理学与分子对接结果显示，AAP、血管内皮损伤、血管生成的交集靶点共 34 个，PPI 网络分析筛选出 14 个核心靶点（包括 PI3K、AKT 等）；KEGG 富集分析发现这些靶点主要富集于 PI3K-AKT 信号通路、Rap1 信号通路等 19 条通路（p<0.05），其中 PI3K-AKT 通路与血管修复密切相关。分子对接结果显示，黄芪甲苷 IV 与 PI3K 的结合能为 - 6.37±0.17kcal/mol，与 AKT 的结合能为 - 5.78±0.48kcal/mol；苦杏仁苷与 PI3K、AKT 的结合能分别为 - 5.23±0.5kcal/mol、-5.16±0.34kcal/mol；芍药苷与 PI3K、AKT 的结合能分别为 - 6.00±0.53kcal/mol、-5.71±0.15kcal/mol，所有结合能均 <-5kcal/mol，且主要通过氢键或 π 键结合，证实 AAP 可与 PI3K/AKT 通路蛋白稳定结合。
体外实验结果显示，PKH26 荧光标记 EPC-Exo 实验表明，AAP 可显著促进 VEC 对 EPC-Exo 的摄取，24h 时 EPC-Exo+AAP 组的 Exo 摄取量显著高于单独 EPC-Exo 组（p<0.01）。CCK-8 实验显示，POVPC 处理显著抑制 VEC 增殖（p<0.01），EPC-Exo+AAP 组增殖活性显著恢复（p<0.01）；划痕实验与管形成实验表明，联合干预可显著提升 VEC 迁移能力（划痕愈合率升高，p<0.01）与管形成能力（管总长度与数量增加，p<0.01），效果优于单独干预。免疫荧光结果显示，POVPC 组 Cleaved-caspase3 荧光强度显著升高（p<0.01），VEGF 荧光强度显著降低（p<0.01），EPC-Exo+AAP 组可显著逆转这一趋势（p<0.01），提示联合干预可抑制 VEC 凋亡并促进血管生成相关分子表达。
WB 检测 PI3K/AKT 通路显示，POVPC 组 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值显著低于对照组（p<0.01），EPC-Exo+AAP 组上述比值显著升高（p<0.01），同时 eNOS、Ang1、VEGF 表达上调（p<0.01）；而加入 AbMole LY294002（PI3K 抑制剂）后，EPC-Exo+AAP 组的 p-PI3K、p-AKT 表达显著降低（p<0.01），VEC 增殖、迁移、管形成能力及 eNOS、Ang1、VEGF 表达均被显著抑制（p<0.01），肌动蛋白染色显示其对 VEC 骨架的修复作用也被逆转，证实 AAP 与 EPC-Exo 的协同修复效应依赖 PI3K/AKT 信号通路激活。
本研究通过体内外实验证实，补阳还五汤来源的 AAP（黄芪甲苷 IV、苦杏仁苷、芍药苷）可与 EPC-Exo 协同促进受损血管内皮修复，其机制与激活 PI3K/AKT 信号通路密切相关。具体而言，AAP 可增强 VEC 对 EPC-Exo 的摄取效率，二者共同作用通过 PI3K/AKT 通路激活，促进 VEC 增殖、迁移与管形成，抑制 VEC 凋亡，上调 eNOS、Ang1、VEGF 等血管保护与血管生成相关分子表达，最终减轻颈动脉球囊损伤后的内膜增生，改善血管功能。
在实验过程中，AbMole 品牌的 LY294002（纯度 99.95%，货号 M1925）作为 PI3K 特异性抑制剂，展现出稳定的通路阻断效果，通过其干预证实了 PI3K/AKT 通路在 AAP 与 EPC-Exo 协同修复效应中的核心作用，为机制验证提供了可靠工具。该研究不仅阐明了 AAP 与 EPC-Exo 协同修复血管内皮的分子机制，也为传统中药活性成分与干细胞来源外泌体联合应用于血管损伤研究提供了实验依据，具有重要的理论与应用价值。