生物化学（实验流程） PCR : 植物提取RNA 电泳评估RNA纯度
文章目录
- RNA提取
- 一、实验步骤总览
- 二、工具和耗材
- 三、操作流程
- 清洗清除
- 预备和研磨
- RNA 提取
- RNA 电泳
- 检测RNA完整性\评估RNA纯度
RNA提取
- 参考视频链接
一、实验步骤总览
二、工具和耗材
- R1-600 总 RNA 提取试剂箱
- RNA 专用离心筒（DEPC 处理）
- RNA 专用枪头和移液枪
- RNA 专用研磨棒和研磨针
- 无 RNase 清洗副耗品（比如 RNA Zap）
- 液氧，无水乙醇，75% 乙醇（DEPC 处理水配笔）
- 漏水槽，风扇等
- 雪光积存器，4℃ 和 -80℃ 冷冻箱
三、操作流程
清洗清除
- 研磨棒、研磨针和钥匙用无水乙醇洗净，烧亮焰消毒，消除 RNase 溃染；
- 清洗完成后，将工具预冷至液氧温度。
预备和研磨
- 将植物样品放入研磨针，加入液氧，硬化样品；
- 带上棉手套，快速研磨，注意全程保持低温，随时补充液氧，防止 RNA 降解；
- 哈哈，有没有人拿这个去做个液氮冰激凌
RNA 提取
-
快速转移至离心筒，加入1 mL RNA 提取试剂，混合，带套需要先冷藏；
-
应用 200 μL 氯仿(或替代物)，先混合，然后等待 3 分钟，进行离心：12,000 rpm，4℃，10 分钟；
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将上层 RNA 水相小心吸取，907 移入新筒，加入等体积异体酒，混合，离心：12,000 rpm，10 分钟；
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置换上清液，添加 75% 乙醇，重复离心：12,000 rpm，5 分钟；
-
打开筒盖，吸出乙醇（注意,不要吸到底下的白色沉淀），风扇吹干，确保乙醇全部振去；
-
加入 30 μL RNase-Free 水，混合溶解 RNA，筒保 4℃ 短期存放，-80℃ 长期存放。
RNA 电泳
凝胶准备
样品准备
- 在RNA样品中加入RNA Loading Buffer。
、
加样与电泳
- 将凝胶放入电泳槽，加入足够的电泳缓冲液覆盖凝胶。
- 用微量枪向凝胶加样孔中缓慢加样。
- 一般每孔上样 0.5~2 μg RNA。
- 同时上RNA Marker（如RiboRuler RNA Ladder）。
检测RNA完整性\评估RNA纯度
- 电泳后应出现清晰的28S和18S rRNA条带，其中28S条带强度约为18S条带的2倍。如果条带模糊、拖尾，说明RNA降解，不适合下游实验。
- 这是因为真核细胞中的核糖体RNA（rRNA）在细胞中的天然比例所决定的，RNA中大部分都是rRNA，主要有以下几种：
| rRNA种类 | 大小（真核） | 归属 | 主要功能 |
|---|---|---|---|
| 28S rRNA | ~5000 nt | 大亚基（60S） | 蛋白合成 |
| 18S rRNA | ~1900 nt | 小亚基（40S） | 蛋白合成 |
| 5.8S rRNA | ~160 nt | 大亚基（60S） | 蛋白合成 |
| 5S rRNA | ~120 nt | 大亚基（60S） | 蛋白合成 |