SCFSlRAE1通过调节SlWRKY1的稳定性来调控番茄对灰霉菌的抗性。

摘要

泛素化是一种关键的翻译后修饰，在植物免疫反应的精细调控中发挥着核心作用。番茄（Solanum lycopersicum）因灰霉菌（Botrytis cinerea）这种毁灭性病原体的侵害而遭受严重的产量和品质损失。我们发现SlRAE1基因（编码一种E3泛素连接酶）是番茄抗灰霉菌的关键负向调控因子。SlRAE1与SlSKP1（SKP1–Cullin1–F-box [SCF]复合体的一个组分）相互作用，通过26S蛋白酶体途径调节转录因子SlWRKY1的蛋白稳定性。SlWRKY1靶向并抑制茉莉酸（JA）信号传导的抑制因子SlJAZ7的转录，从而激活JA诱导的防御系统，进而影响番茄对灰霉菌的敏感性。当SlWRKY1也被敲除时，敲除SlRAE1所增强的抗性减弱，这突显了SlWRKY1在SlRAE1调控番茄抗灰霉菌防御中的作用。我们的研究揭示了番茄的防御机制，并表明通过调节SlWRKY1的稳定性来靶向SlRAE1，有助于培育抗灰霉菌的番茄品种。这些发现为利用基因编辑技术增强作物对真菌的防御能力提供了更广泛的意义。

引言

番茄是一种重要的蔬菜作物，其生产受到季节性疾病的挑战，尤其是在春季保护栽培中常见的高湿度和低光照条件下，灰霉菌（Botrytis cinerea）的影响尤为突出（Xie 等，2024）。由于灰霉菌具有通过空气快速传播的特性，这给田间防治带来了相当大的困难。因此，开发具有强大防御系统的番茄品种以减轻疾病对番茄种植的不利影响是一个重要目标，而实现这一目标的关键在于理解番茄防御的分子机制。

灰霉菌是一种具有广泛宿主范围的坏死营养型病原体，被认为是第二重要的植物真菌病原体（Dean 等，2012；Van Kan 等，2016）。模式识别受体触发的免疫（PAMP-triggered immunity, PTI）是植物抵御灰霉菌的重要组成部分，信号转导途径、转录因子调控和激素控制成为当前研究的焦点（Bi 等，2023；Li 等，2024）。灰霉菌严重阻碍了植物的生长和果实的发育（Yigal 等，2007；Fillinger，2016）。灰霉菌接种会在拟南芥中引发氧化爆发和过敏性细胞死亡。抗性调控涉及翻译后修饰。在番茄中，SlMKK2 和 SlMKK4（而非其他三种 SlMKKs，即 SlMKK1、SlMKK3 和 SlMKK5）被认为与抗灰霉菌有关。在番茄中沉默 SlMKK2 或 SlMKK4 会导致抗灰霉菌能力减弱，活性氧（reactive oxygen species）积累增加，以及在灰霉菌感染后防御基因表达降低（Li 等，2014）。

WRKY转录因子在植物抗灰霉菌（Botrytis cinerea）中发挥着重要作用（Ma等，2021）。在杂种玫瑰（Rosa hybrida）中，由灰霉菌诱导的转录因子RhWRKY13已被鉴定为拟南芥AtWRKY40的同源物。它通过促进花瓣中细胞分裂素（CK）水平的增加和脱落酸（ABA）水平的降低，增强对灰霉菌的抗性，同时抑制细胞分裂素降解酶RhCKX3和ABA响应元件RhABI4的活性（Liu等，2023）。拟南芥的CCCH蛋白C3H14通过WRKY33信号通路增强对灰霉菌的基本防御，激活ORA59和PAD3级联反应，从而调节茉莉酸（JA）和乙烯（ET）介导的防御反应（Wang等，2020）。在番茄中，SlWRKY30和SlWRKY81协同调节番茄的免疫反应（Dang等，2023）。WRKY40和WRKY33在响应灰霉菌感染时会结合到CKX5的启动子上（Ali等，2024）。葡萄中拟南芥AtWRKY18、AtWRKY40和AtWRKY60的同源物VaWRKY10在高抗性叶片中表达量高，而在敏感品种中被灰霉菌诱导的水平较低。在转基因拟南芥和欧洲葡萄中过表达VaWRKY10，与野生型（WT）相比，接种后的抗病性显著提高，证明了VaWRKY10对灰霉菌抗性的作用（Wan等，2021）。拟南芥的WRKY8转录因子在植物免疫反应中具有双重作用，一方面抑制对细菌病原体丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的基础抗性，另一方面增强对真菌病原体灰霉菌的抗性，从而突显了WRKY8在抗病机制中复杂的参与方式（Chen等，2010）。过度表达WRKY33可以显著增强拟南芥对灰霉菌的抗性（Zheng等，2006）。WRKY33在PTI中的主要作用是促进乙烯（ET）合成（目标基因ACS2和ACS6），调节ET信号传导途径（活性蛋白GDSL脂肪酶1，GLIP1），调节茉莉酸（JA）信号传导途径（目标基因ORA59、JAZ1、JAZ5），以及抑制水杨酸（SA）和ABA的合成及其信号传导途径（Birkenbihl等，2012）。

泛素化是调控植物与病原体相互作用的关键过程，依赖于三个核心组分的协同作用：泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3。多种E3泛素连接酶，如U-box、RING型和CRL型E3连接酶，通过调节底物蛋白的降解或亚细胞定位来增强植物免疫（Zhou和Zeng，2017；Ma等，2021）。SCF家族的泛素连接酶以其由Cullin1（CUL1）、SKP1、RBX1和F-box蛋白组成的独特结构而著称。在拟南芥中，由ASK（拟南芥SKP1类似蛋白）、CUL1和F-box蛋白组成的SCF复合体与靶蛋白相互作用以介导泛素化（del Pozo和Estelle，2000；Zheng等，2002；Li等，2017）。当拟南芥的E3泛素连接酶PUB13被T-DNA插入破坏时，植物对坏死营养型病原体的抗性降低（Li等，2012）。拟南芥中BOI1的表达可被灰霉菌（B. cinerea）诱导，并通过靶向R2R3 MYB转录因子BOS1（灰霉菌易感性1）进行泛素化和降解来调节抗性（Luo等，2010）。作为F-box蛋白，拟南芥中的CPR30（细胞色素P450还原酶30）与多种ASK蛋白相互作用，通过泛素-蛋白酶体途径调节水杨酸（SA）依赖和非依赖的防御信号传导（Gou等，2009）。PIF3（光敏色素互作因子3）蛋白的稳定性由包含EBF1/2（乙烯结合F-box）组分的SCF复合体控制，该蛋白参与光介导的形态发生调控（Dong等，2017）。SON1（Nim1-1的抑制因子）是F-box蛋白家族的成员，参与拟南芥中SA防御反应的调节以及系统获得性抗性的建立（Kim和Delaney，2002）。在番茄和本氏烟（Nicotiana benthamiana）中，ACIF1（Avr9/Cf-9诱导的F-box蛋白1）编码一种具有亮氨酸富集重复序列（LRR）结构域的F-box蛋白，影响对本氏烟花叶病毒（TMV）感染的防御，影响病斑形成和SA积累。ACIF1通过调节对茉莉酸甲酯和脱落酸响应的基因来调控防御反应（van den Burg等，2008）。

茉莉酸是植物生理中一个关键且在进化上保守的调节因子，尤其在赋予植物抗性方面起着重要作用（van den Burg等，2008；Du等，2017；Hong等，2024）。转录因子MYC2（骨髓细胞白血病2型）及其下游转录因子形成了一个分层的转录级联反应，调控番茄中茉莉酸介导的植物免疫（Du等，2017）。茉莉酸在激活创伤诱导的蛋白酶抑制剂（PIs）和其他防御相关基因的表达中发挥着至关重要的作用（Sun等，2011）。番茄的spr8突变体表现出一系列茉莉酸依赖的免疫缺陷，例如表达创伤响应基因的能力受损、腺毛发育异常以及对棉铃虫（Helicoverpa armigera）和灰霉菌（Botrytis cinerea）的抗性严重降低。spr8突变体的这种表型是由于TomLoxD催化结构域中的一个点突变引起的，TomLoxD是一种位于叶绿体中的脂氧合酶，对茉莉酸生物合成至关重要（Yu等，2013）。据报道，SlNAC063/JA2L通过茉莉酸介导气孔运动参与番茄对疾病的防御（Du等，2014）。植物激素7-iso-(+)-茉莉酸-L-异亮氨酸（JA-Ile）作为茉莉酸的活性形式，作用于植物的防御反应以激活诱导免疫（Wasternack和Hause，2013；Zhang等，2015；Takaoka等，2018）。在植物防御反应中，JA-Ile诱导CORONATINE INSENSITIVE1（COI1）和茉莉酸ZIM结构域（JAZ）转录因子抑制蛋白（Wasternack和Hause，2013；Zhang等，2015；Takaoka等，2018）。JAZ蛋白在茉莉酸信号通路中作为转录抑制因子，MED7（中介体7）直接与JAZ蛋白相互作用，形成共抑制复合体，抑制茉莉酸防御基因的表达，从而使植物的免疫反应处于抑制状态（Wu等，2023）。据报道，JAZ参与了许多物种的应激反应，其中大多数是由茉莉酸诱导的（Blazquez等，2017；Bisht等，2023）。JAZ蛋白通过与适配器蛋白NINJA（JAZ的新型相互作用因子）直接或间接相互作用，招募转录共抑制因子TOPLESS（TPL），另一种含有EAR基序的共抑制因子，以进一步抑制MYC2/3/4的激活（Pauwels等，2010；Zhang等，2015）。JAZ是茉莉酸途径中的一类核抑制因子，可以与MYC蛋白结合并调节茉莉酸响应基因的表达（Lorenzo等，2004；Dombrecht等，2007）。E3泛素连接酶PUB22通过泛素化降解JAZ4蛋白激活茉莉酸信号通路，而被激活的MYC2通过转录调控进一步促进PUB22的表达，形成了茉莉酸信号传导中正反馈调节通路的分子机制（Wu等，2024）。

结果

SlRAE1作为番茄抗灰霉菌的负向调控因子

在以往的研究中，我们曾报道SlRAE1主要在番茄根部介导对铝毒性的抗性（Zhang等，2022）。然而，组织表达分析显示SlRAE1在番茄地上部分（如叶片和果实）中表达量很高（图S1A）。这促使我们探究SlRAE1是否具有超出铝抗性（主要在根部发挥作用）的其他功能。对SlRAE1保守结构域的分析发现，它主要由N端的F-box结构域和C端的亮氨酸重复序列（LRR）结构域组成，表明它编码一种E3泛素连接酶（图S1B）。LRR结构域是植物抗性（R）蛋白中常见的基序（Song等，1995；Wang等，2022；Huang等，2024；McClelland和Ma，2024），对植物的先天免疫至关重要。参与植物防御的LRR蛋白家族包括类受体蛋白激酶、核苷酸结合蛋白、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白以及延伸蛋白家族（Hu等，2023）。因此，我们推测SlRAE1可能在番茄的病害抗性中发挥作用。

灰霉菌（Botrytis cinerea）会在多种作物中引发灰霉病和腐烂病。番茄是研究植物抗灰霉菌病原体侵染的重要模式植物。因此，我们测量了野生型（WT）番茄在接种灰霉菌后SlRAE1的表达水平。定量实时PCR（qRT-PCR）结果显示，SlRAE1的表达在接种后1小时内被诱导，并在9小时达到峰值（图S1C）。我们利用CRISPR/Cas9系统创制了SlRAE1基因敲除株系，并通过番茄遗传转化技术获得了SlRAE1过表达株系。两个纯合的CRISPR/Cas9编辑株系rae1#62（在第一个外显子中有一个62个碱基的缺失，导致在F-box保守结构域之前出现提前终止密码子）和rae1#3（在第一个外显子中分别有2个和3个碱基的缺失，导致在F-box结构域之前出现提前终止密码子）（图S2A，B）。过表达株系通过转基因技术生成。西方印迹（Western blot）显示，OE-1和OE-6能够被抗Flag抗体检测到，其转录水平比对照组高出15倍（图S2C，D）。为了测试SlRAE1对灰霉菌介导的病害的抗性影响，我们将SlRAE1基因敲除株系和过表达株系接种灰霉菌。与野生型叶片相比，两个敲除株系（rae1#62和rae1#3）表现出更强的抗性，病斑面积更小，而过表达株系的病斑面积则比野生型更大。这两个突变株系在接种灰霉菌后没有明显的感染位点，并且在台盼蓝染色下叶片上的死亡细胞更少（图1A）。相比之下，过表达株系的叶片表面出现了许多感染斑点（图1B）。突变株系的Fv/Fm值显著高于野生型和过表达株系（图1C）。果实的表型在接种后与叶片相似。SlRAE1基因敲除株系的果实病斑面积小于野生型，而过表达株系的病斑面积更大（图1D–F）。我们测量了不同株系果实接种后的离子渗漏情况。与野生型相比，OE-1和OE-6的果实离子渗漏更高。然而，在rae1#62、rae1#3和野生型之间没有发现显著差异（图1G）。接种后，SlJA2L和SlPR-STH2的表达水平显著增加，在rae1#3和rae1#62中水平更高，而在过表达株系中水平较低（图1H，I）。总之，SlRAE1在灰霉菌抗性中发挥了负向调控作用。

SlRAE1–SlSKP1–SlCullin1在SCF复合体框架内的相互作用

F-box E3泛素连接酶通常以SCF复合体的形式参与底物蛋白的降解。为了确认具有F-box结构域的SlRAE1是否能够形成SCF复合体并作为E3泛素连接酶发挥作用，我们验证了它与SKP1和Cullin1蛋白的相互作用。在番茄中鉴定出三种拟南芥ASK蛋白的同源蛋白，分别由Solyc01g111650、Solyc01g111640和Solyc10g055570编码。然后，我们利用酵母双杂交（Y2H）系统验证了它们之间的相互作用。将SlRAE1的全长编码序列克隆到pGBKT7中，将SlSKP1s和SlCullin1的全长序列克隆到pGADT7中。结果显示，SlRAE1仅与由Solyc01g111650编码的SlSKP1蛋白相互作用（图2A）。酵母双杂交实验和荧光素酶互补成像（LCI）实验的结果表明，SlRAE1不能与其他ASK家族的同源成员相互作用，包括由Solyc01g111640编码的SlASK640和由Solyc10g055570编码的SlASK570，无论是在酵母系统中还是在本氏烟（N. benthamiana）中（图S3A、B）。荧光素酶互补成像实验进一步证实了SlRAE1与SlSKP1的相互作用，其中SlRAE1和SlSKP1分别与荧光素酶的N端和C端融合。而SlSTOP1–SlSZP1的相互作用被用作阳性对照组，SlRAE1‐nLUC和SlMAPK‐cLUC被用作阴性对照（图2B、C）。共免疫沉淀（Co-IP）实验显示，在体内，带有GFP标签的SlSKP1能够与带有Flag标签的SlRAE1发生免疫沉淀（图2D）。荧光素酶互补成像实验进一步证实了SlSKP1与SlCullin1之间的相互作用（图2E、F）。为了验证SlRAE1是否能够与SlSKP1和SlCullin1组装成SCF复合体，我们利用酵母三杂交（Y3H）实验检测了SlRAE1、SlSKP1和SlCullin1之间的相互作用。pGADT7–SlCullin1和pBridge–SlRAE1–SlSKP1的组合在SD/−Leu/−Trp平板上正常生长。结果表明，SlSKP1作为桥梁增加了SlRAE1与SlCullin1的结合（图2G），并证实了SlRAE1能够通过与SlSKP1和SlCullin1的相互作用形成SCF复合体。

SlRAE1与SlWRKY1的相互作用

F-box蛋白作为E3泛素连接酶，通过特异性相互作用调控靶蛋白的稳定性。亚细胞定位实验显示，SlRAE1定位于细胞核和细胞质中，表明SlRAE1可能参与多种细胞过程（图3A）。通过下拉质谱（pull-down mass spectrometry, MS）分析（表S1），我们确定了SlRAE1的几个候选底物，其中SlWRKY1脱颖而出。SlWRKY1是AtWRKY40的同源物，AtWRKY40是一种先前被认为与灰霉菌（Botrytis cinerea）抗性相关的转录因子，这强调了SlWRKY1在抵御灰霉菌的防御机制中可能发挥的作用。我们利用酵母双杂交（Y2H）实验检测了SlWRKY1与SlRAE1之间的相互作用。将pGBKT7–SlRAE1和pGADT7–SlWRKY1共转化到酵母细胞中，这些细胞显示出正常的生长和β-半乳糖苷酶活性，在QDO/X-α-gal（SD/−Leu/−Trp/−His/−Ade/X-α-gal）指示平板上呈现出蓝色，与阳性对照相似（图3B）。通过荧光素酶互补成像（LCI）实验进一步证实了这种体内相互作用，共表达nLUC-SlRAE1和cLUC-SlWRKY1的本氏烟（N. benthamiana）叶片检测到强烈的发光信号（图3C、D）。共免疫沉淀（co-immunoprecipitation）实验进一步验证了这种相互作用，结果显示，只有在同时表达SlWRKY1-GFP和SlRAE1-HA的组合中检测到了SlWRKY1-GFP融合蛋白，表明SlWRKY1-GFP与SlRAE1-HA发生了免疫沉淀（图3E）。此外，在本氏烟中共表达SlRAE1-CE和SlWRKY1-NE时，细胞核中出现了强烈的绿色荧光，而阴性对照中未检测到荧光信号（图3F）。综上所述，这些发现证实了SlRAE1与SlWRKY1之间的相互作用。

SlWRKY1通过26S蛋白酶体途径被SlRAE1降解

为了研究SlWRKY1是否作为SCFSlRAE1复合体的底物通过26S蛋白酶体途径被降解，我们在灰霉菌（Botrytis cinerea）接种后，使用特异性抗体分析了内源性SlWRKY1蛋白的水平。结果显示，SlWRKY1蛋白的积累水平在接种后48小时增加，随后在72小时下降。使用MG132（一种蛋白酶体抑制剂）处理抑制了对照组中SlWRKY1的降解（图4A）。酵母三杂交实验进一步证实了SlRAE1能够介导SlSKP1与SlWRKY1的相互作用（图4B）。体外降解实验表明，在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中过表达SlRAE1能够降低SlWRKY1-GST融合蛋白的水平，与对照组相比差异显著（图4C）。由于SlRAE1能够与SlSKP1和SlCullin1形成SCF复合体，双荧光素酶（Dual-LUC）实验进一步证实了SlWRKY1作为SCF复合体的底物被降解，以空载体GFP作为对照（图4D、E）。进一步的实验在番茄的SlRAE1基因敲除和过表达株系中表明，过表达SlRAE1加速了SlWRKY1-GST融合蛋白的降解，而敲除SlRAE1则稳定了该融合蛋白，与野生型（WT）相比差异显著（图4F）。在灰霉菌接种后，SlWRKY1蛋白在SlRAE1基因敲除株系中保持稳定，而在野生型和SlRAE1过表达株系中则下降。过表达SlRAE1显著促进了接种后72小时SlWRKY1蛋白的降解（图4G）。为了验证SlWRKY1是否被SlRAE1泛素化，我们使用了一种含有部分F-box结构域的SlRAE1-F-GFP融合蛋白。与对照组相比，SlRAE1能够在体内对SlWRKY1进行泛素化，从而将其标记为蛋白酶体降解的靶标（图4H）。这些结果表明，SlRAE1作为E3泛素连接酶，在SCF复合体中发挥作用，通过26S蛋白酶体途径靶向SlWRKY1进行泛素化和随后的降解。

SlWRKY1是番茄抗灰霉菌的正向调控因子，并且作用于SlRAE1的下游

为了测试SlWRKY1是否对番茄抗灰霉菌（Botrytis cinerea）有贡献，我们利用CRISPR/Cas9技术生成了两个SlWRKY1基因敲除株系：wrky1#1（在第二个外显子中分别缺失5个和7个碱基）和wrky1#2（在第二个外显子中缺失281个碱基），使它们无法表达WRKY结构域（图S4A–C）。通过杂交获得了SlRAE1和SlWRKY1的双突变株系。为了测试双突变株系与单突变株系在抗灰霉菌方面的差异，我们对wrky1#1和wrky1#2、rae1#62 wrky1#1、rae1#3 wrky1#2以及野生型（WT）的番茄叶片和果实进行了灰霉菌接种。接种后3天，我们量化了病斑面积。wrky1#1和wrky1#2叶片的病斑面积显著大于野生型。同时，rae1#62 wrky1#1和rae1#3 wrky1#2叶片的病斑面积也显著大于野生型。特别是，wrky1#1和wrky1#2对灰霉菌表现出高度易感性。单突变株系和双突变株系在台盼蓝染色下显示出比野生型更大的死亡细胞区域（图5A，B）。我们测量了接种后叶片的Fv/Fm值，发现双突变株系和SlWRKY1单突变株系的Fv/Fm值显著低于野生型（图5C）。此外，单突变果实的病斑面积显著大于野生型和双突变株系，而双突变果实的病斑面积大于野生型（图5D–F）。然后，我们测量了接种后果实的离子渗漏情况；单突变株系和双突变株系的离子渗漏显著高于野生型（图5G）。此外，包括SlJA2L和SlPR-STH2在内的茉莉酸响应基因和病害相关基因的相对表达水平在单突变株系和双突变株系中显著低于野生型（图5H，I）。这些结果表明，敲除SlWRKY1显著增强了对灰霉菌的易感性。然而，在SlWRKY1敲除背景下敲除SlRAE1可以缓解这种增加的易感性。这表明SlWRKY1在遗传上作用于SlRAE1的下游。

SlWRKY1通过茉莉酸（JA）途径调控对灰霉菌（Botrytis cinerea）的抗性

已有研究表明，茉莉酸（JA）参与调控植物对灰霉菌（Botrytis cinerea）的抗性（Luo等，2023a）。我们发现，经茉莉酸甲酯（MeJA）处理后，SlWRKY1的表达水平增加（图6A）。JAZ蛋白在JA信号传导途径中起抑制作用，WRKY家族成员通过结合其启动子直接调控JAZ的表达（Wang等，2024）。在灰霉菌接种后，对SlJAZ家族成员的表达分析显示，有九个成员上调，四个成员下调，其中SlJAZ7显著上调（图S5）。我们分析了SlJAZ7的启动子，发现了多个结合元件，包括WRKY转录因子的W-box，这表明SlWRKY1可能通过结合其启动子来调控SlJAZ7。酵母单杂交（Y1H）实验确认SlWRKY1直接结合到SlJAZ7的启动子上（图6B）。双荧光素酶报告基因实验显示，SlWRKY1抑制了SlJAZ7的转录，通过SlJAZ pro::LUC报告基因确定（图6D，E）。我们将SlJAZ7的启动子分为两个片段，P1和P2（图6C）。结果显示，与对照组相比，只有P2组的活性受到显著抑制，而P1组没有显著抑制（图6D，E）。基于结合元件分析和双荧光素酶实验的结果，我们在SlJAZ7启动子的P2片段设计了一个电泳迁移率变化分析（EMSA）探针（图6C）。EMSA实验进一步验证了SlWRKY1直接结合到SlJAZ7启动子片段上。SlWRKY1直接与生物素标记的探针结合，且在添加未标记的竞争探针后，其结合强度降低（图6F）。在SlWRKY1基因敲除株系中，SlJAZ7的表达水平显著增加（图6G），而在SlRAE1基因敲除株系中，SlJAZ7的表达受到显著抑制（图S6A）。此外，我们检测了SlMYC2的表达水平，结果显示，与野生型（WT）和SlRAE1基因敲除株系相比，SlWRKY1基因敲除株系中SlMYC2的表达水平显著降低（图S6B）。这些结果表明，SlWRKY1通过直接结合到其启动子上抑制SlJAZ7的表达，从而在番茄感染灰霉菌后激活JA信号传导途径。