采用多维计算策略(分子动力学模拟+机器学习)，显著提升 α-半乳糖苷酶热稳定性
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在工业应用领域，α-半乳糖苷酶在食品加工、动物营养及医疗等方面发挥着重要作用。然而，微生物来源的该酶往往存在热稳定性不足的问题，限制了其在工业场景中的高效应用。近日，来自江南大学的团队在《International Journal of Biological Macromolecules》发表最新研究，通过多维计算策略成功提升了米曲霉 α-半乳糖苷酶的热稳定性与催化效率，为工业酶的分子改造提供了新范式。
结果速览
1. 双策略框架：计算工具与分子模拟的协同创新
①策略一：多工具整合的突变库设计
利用 ABACUS2、PROSS、DBD2 等计算工具构建突变库，通过 Consurf 和 GREMLIN 分析序列保守性，结合 FoldX 计算展开自由能变化（ΔΔG）和 PROSS 的位置特异性评分矩阵（PSSM）筛选突变位点。最终获得优势突变体A169P，其在 pH 4.0、55℃条件下的热半衰期提升 78.52%（从 10.57 分钟延长至 18.87 分钟），催化效率（Kcat/Km）提高 52.04%。
图1. 多维计算策略流程图
②策略二：分子动力学与机器学习的联合预测
通过 GROMACS 进行 100 ns 分子动力学模拟，识别出 50 个高波动位点（RMSF>0.13），结合 Rosetta 的 cartesian_ddg 计算和 SPIRED 机器学习模型（SPIRED-Stab/SPIRED-Fitness），筛选出 E429I、N380L、T64P 三个稳定变体。其中，E429I 和 T64P 的热半衰期分别延长 57.33% 和 41.34%，同时催化效率提升 85.25% 和 65.90%。
图2. 分子动力学模拟结果，显示高波动位点筛选过程
2. 关键机制：结构稳定与催化性能的平衡
① 局部构象优化与疏水作用增强
突变体 A169P 和 T64P 通过引入脯氨酸（Pro）强化环区刚性，减少局部构象波动。例如，A169P 位于非催化区域，通过稳定酶的催化构象间接提升活性；E429I 通过将亲水谷氨酸替换为疏水异亮氨酸，促进 C407-C430 二硫键的形成与维持，增强整体稳定性。
图3. 突变位点的分子结构分析，显示了脯氨酸对环区的刚性作用
②底物特异性与动力学优化
针对 pNPG 和棉子糖两种底物的动力学分析表明，A169P 和 E429I 均显著降低米氏常数（Km），提升底物亲和力。其中，E429I 对 pNPG 的(Kcat/Km)提升 85.25%，归因于其增加的亲水性表面积（SASA）改善了溶剂相容性。
图4. 酶-底物复合物的分子动力学模拟，对比野生型与突变体的结合稳定性
传统定向进化需筛选大量突变体，而本研究通过计算策略将突变库规模从数千缩小至数十个，显著降低实验工作量。例如，策略一通过多指标过滤（保守性评分、ΔΔG<-0.5、PSSM≥0）将初始 236 个突变精简为 18 个候选，最终仅需验证 5 个高潜力突变体。
α-半乳糖苷酶在饲料加工中需耐受高温制粒过程，而野生型酶易失活。优化后的突变体在 pH 4.0（模拟动物胃肠道酸性环境）和 55℃条件下表现出显著稳定性，可有效降解大豆粕中的抗营养因子（如棉子糖家族寡糖），提升饲料消化率。
总结
该研究整合序列保守性分析、分子动力学模拟、机器学习预测等多维计算工具，建立了酶分子设计的通用框架。未来，结合更多元的算法（如深度学习预测蛋白质 - 配体相互作用）和实验验证，有望进一步加速工业酶的功能优化，推动绿色生物制造技术的发展。